质粒转化大肠杆菌演示文稿

质粒转化大肠杆菌演示文稿目前一页\总数十四页\编于点优选质粒转化大肠杆菌目前二页\总数十四页\编于点1、重组质粒的鉴定当质粒的重组或其他载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的本身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其他载体中含有相应的抗生素抗性基因，若重组成功，或不含质粒的自身环化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传代。若重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2、为扩增质粒和其他载体作准备由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20-30min，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时间内极大的扩增目的质粒。一、实验目的目前三页\总数十四页\编于点二、实验原理通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。目前四页\总数十四页\编于点三、实验流程：灭活物/质粒转化大肠杆菌挑菌摇菌菌液PCR目前五页\总数十四页\编于点四、实验方法---冻融法连接产物灭活70℃，10min（冰上解冻）大肠杆菌感受态细胞50μl、灭火物10μl混合物，冰上放置30min42℃,90sec冰上2min加入1000ulLB液体（无抗）37℃，振荡1h离心10000rpm,1min,RT去上清800μl留下200μl上清于1.5ul离心管中重悬涂板37℃恒温箱，倒置培养12h(时间不得超过20h)目前六页\总数十四页\编于点1、无菌落，失败，或培养条件不充分。2、菌落布满如苔样，失败，可能是抗生素浓度不够或失效。3、菌落布满，抗生素浓度太高，失败。4、出现菌落，符合要求。（1）（2）（3）（4）目前七页\总数十四页\编于点五、结果分析和失败原因（1）有菌落，说明转化成功，但有两种可能性：其一，质粒自身环化；其二，重组成功。（2）无菌落，说明实验没成功。（3）菌落布满如苔样，可能是抗生素浓度不够或失效。（4）出现大菌斑，大多数是霉菌污染所致。1、结果分析目前八页\总数十四页\编于点1、平板中的抗生素部分失效，长出的克隆是杂菌。2、倒Ka平板时，培养基太烫，应冷却到50℃以下加Ka抗生素。2、涂板时来回用力过大，涂布环或者涂布棒灼烧过热，或不待冷却就涂布。3、感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响其转化，操作时动作迅速。4、操作时动作过于剧烈，减少对细胞的机械损伤。切记感受态细胞比较娇嫩。5、操作过程不规范，染菌。2、转化失败的原因目前九页\总数十四页\编于点六、大肠杆菌感受态细胞的制备（1）从LB平板上挑取新活化的E.coli

TOP10单菌落于50mlLB培养基中，37℃振荡过夜；（2）将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右；（3）将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下4100rpm离心10min。（4）弃掉上清,加入30ml0.1mol/L预冷的CaCl2溶液，重悬，冰上放置15-30min后，4℃下4100rpm离心10min；（5）弃掉上清，加入2ml预冷的0.1mol/L的CaCl，加入无菌甘油300μl，重悬混匀,冰上放置几分钟；（6）分装，每管100μl，液氮冷冻后,保存于-70℃冰箱。目前十页\总数十四页\编于点七、挑菌、摇菌

（1）离心管标号（2）每个管内吸入650μlLB+Ka抗生素（3）用牙签挑取单个菌（4）摇床上摇菌（时间大于8h）准备：离心管、牙签、镊子、LB+抗生素目前十一页\总数十四页\编于点八、蓝白斑筛选原理

蓝白斑筛选-----筛选重组子：根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在许多载体都含有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）。受体菌则含编码β-半乳糖苷酶C端aa的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β-半乳糖苷酶表达，在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）培养基中形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。目前十二页\总数十四页\编于点

蓝白斑筛选：（1）未转化的菌不具有抗性，不生长；（2）转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；（3）转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。目前十三页\总数十四页\编于点九、菌液PCR验证加样：easybuffer:2.5μl×样数

DNTP：1.5μl×样数

M13R:1μl×样数M13F:1μl×样数ea