蛋白质与酶工程第五章酶和细胞固定化演示文稿

蛋白质与酶工程第五章酶和细胞固定化演示文稿目前一页\总数一百三十五页\编于十七点优选蛋白质与酶工程第五章酶和细胞固定化目前二页\总数一百三十五页\编于十七点Contentsofchapter51、什么是固定化技术和固定化酶2、固定化酶的研究历史3、酶的固定化技术4、固定化酶的特点GoGoGoGo6、细胞、原生质体的固定化5、固定化酶的应用GoGo目前三页\总数一百三十五页\编于十七点5.1什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术目前四页\总数一百三十五页\编于十七点化学偶联酶固定化间歇可溶交联包埋吸附间歇连续酶的固定化技术和固定化酶目前五页\总数一百三十五页\编于十七点固定化酶：经提取和分离纯化后的酶固定化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片固定化细胞：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞目前六页\总数一百三十五页\编于十七点优点：不溶于水，易于与产物分离；可反复使用；可连续化生产；稳定性好。缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活

首次投入成本较高

大分子底物较困难本章目录目前七页\总数一百三十五页\编于十七点固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilizedenzyme。5.2固定化酶的研究历史目前八页\总数一百三十五页\编于十七点随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞技术。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。本章目录目前九页\总数一百三十五页\编于十七点5.3酶固定化技术活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。固定化酶操作的注意事项目前十页\总数一百三十五页\编于十七点目前十一页\总数一百三十五页\编于十七点酶固定化方法（一）吸附法（二）包埋法（三）结合法（四）交联法目前十二页\总数一百三十五页\编于十七点1、吸附法

利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。

优点：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。

缺点：由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。目前十三页\总数一百三十五页\编于十七点2、包埋法

将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。根据载体材料和方法的不同，可分为：凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等目前十四页\总数一百三十五页\编于十七点

按照包埋后的形状不同，包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶网格中的称为网格型，将酶包埋在球状半透膜中的称为微囊型。包埋法一般不需要与酶形成共价键的反应，几乎不改变酶的高级结构，酶活回收率高，因此可以用于许多酶、细胞、细胞器的固定化。目前十五页\总数一百三十五页\编于十七点（1）网格型

形成网格有两种方法，一种方法是把酶或细胞与能形成高分子聚合物的单体混合，然后使单体聚合成网格状凝胶，如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂等，酶或细胞就被包埋在网格中。另一种方法是将溶胶状的天然高分子物质与酶或细胞混合，然后凝胶化，如淀粉、琼脂、明胶、胶原、海藻酸、角叉菜胶等。网格型包埋是固定细胞用得最多且最有效的方法。目前十六页\总数一百三十五页\编于十七点（2）微囊型

微囊通常是直径几微米到几百微米的球状体，内有含酶的溶液，微囊的膜可让小分子物质通过，但酶不能通过。小分子底物通过扩散进入囊内，经酶反应生成产物后再扩散出来。作为膜材料的有硝酸纤维素（用乙醇和乙醚混合液溶解则为火棉胶）、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙、聚酰胺、聚脲等。目前十七页\总数一百三十五页\编于十七点微囊型固定化酶的特点

微囊型颗粒比网格型颗粒要小得多，有利于底物和产物的扩散，但微囊制备时反应条件要求高，制备成本也高。脂质体是用表面活性剂和卵磷脂制成的液膜微囊。

目前十八页\总数一百三十五页\编于十七点包埋法的优缺点包埋法操作简单，适用于大多数酶；包埋时不改变酶的结构，不影响酶的活性。

在发生化学聚合反应时包埋，酶容易失活，必须小心设计反应条件。包埋法只适合于固定那些底物和产物均为小分子的酶，对于那些作用于大分子的酶来说是不合适的，因为只有小分子底物和产物才能通过高分子凝胶的网格及半透膜扩散，而大分子底物无法与网格中或微囊中的酶或细胞接触。

目前十九页\总数一百三十五页\编于十七点首先被采用包埋法的是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙烯酰胺，丙烯酰胺，引发剂目前二十页\总数一百三十五页\编于十七点海藻酸钙包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控目前二十一页\总数一百三十五页\编于十七点脂质体包裹目前二十二页\总数一百三十五页\编于十七点3、结合法

选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法共价键结合法目前二十三页\总数一百三十五页\编于十七点离子结合法离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如DEAE-纤维素、AmberliteCG-50、XE-97和Dowex-50等。DEAE——二乙胺基乙基目前二十四页\总数一百三十五页\编于十七点离子结合法的优缺点离子结合法优点操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。缺点是载体和酶的结合力较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度较高的条件下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。目前二十五页\总数一百三十五页\编于十七点共价结合法共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体。一般先用化学方法将载体活化，再与酶分子表面的某些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价键。目前二十六页\总数一百三十五页\编于十七点载体活化的主要反应重氮法叠氮法溴化氰法芳香烃化法目前二十七页\总数一百三十五页\编于十七点CompanyLogo（1）重氮法重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。目前二十八页\总数一百三十五页\编于十七点CompanyLogo（2）叠氮法即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶。其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。目前二十九页\总数一百三十五页\编于十七点CompanyLogo（3）溴化氰法即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。目前三十页\总数一百三十五页\编于十七点CompanyLogo（4）烷基化和芳基化法以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。目前三十一页\总数一百三十五页\编于十七点CompanyLogo优点：共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。缺点：载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空间构象变化。共价键结合法目前三十二页\总数一百三十五页\编于十七点目前三十三页\总数一百三十五页\编于十七点4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。目前三十四页\总数一百三十五页\编于十七点交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。目前三十五页\总数一百三十五页\编于十七点（1）吸附交联法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。（2）交联包埋法把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。目前三十六页\总数一百三十五页\编于十七点酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶目前三十七页\总数一百三十五页\编于十七点目前三十八页\总数一百三十五页\编于十七点各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法包埋法结合法交联法物理吸附共价键结合离子键结合制备难易易较难难易较难固定化程度弱强强中等强活力回收率较高高低高中等载体再生可能不可能不可能可能不可能费用低低高低中等底物专一性不变不变可变不变可变适用性酶源多小分子底物、药用酶较广广泛较广目前三十九页\总数一百三十五页\编于十七点传统的酶固定化方法的缺点：

酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点不能充分暴露，而且酶的固定化量降低，因此定向固定化酶技术将成为今后固定化酶研究的热点。目前四十页\总数一百三十五页\编于十七点新型的酶固定化方法新型的酶的固定化方法，要在较为温和的条件下进行，尽量减少或避免酶活力的损失，并提高固定化效率。通过辐射、光、等离子体、电子、“柔性链”等新方法均可制备高活性固定化酶。目前四十一页\总数一百三十五页\编于十七点如光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。目前四十二页\总数一百三十五页\编于十七点等离子体是高度激发的原子、分子、离子以及自由基的聚集体，大量的等离子体常在室温下存在。载体材料表面可以用等离子体进行修饰，从而引入活性基团。目前四十三页\总数一百三十五页\编于十七点偶合（耦合）固定化也是新近发展起来的一种酶固定化方法，基本上能够解决单一固定化方法酶活回收率低、稳定性差、传质阻力大等问题，并具有方法多样、操作简便、技术成熟等特点。目前四十四页\总数一百三十五页\编于十七点从较早的吸附—交联法、包埋—交联法开始，偶合固定化技术已经得到越来越多的应用，先后提出并研究了包埋—吸附法、絮凝—吸附法、吸附—交联法、膜—吸附法等方法。目前四十五页\总数一百三十五页\编于十七点无载体固定化酶直接利用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶和喷雾干燥酶而形成交联溶解酶、交联酶晶体、交联酶聚集体和交联喷雾干燥酶等4种无载体酶系统。目前四十六页\总数一百三十五页\编于十七点与传统固定化酶相比，无载体酶具有以下一些优点：①催化活性高，成本低；②具备较高的催化剂比表面；③可加入多种酶；④底物扩散受限较少；⑤在极端条件、有机溶剂和蛋白酶中的稳定性较高。目前四十七页\总数一百三十五页\编于十七点此外，研究人员还开发了一些定向固定化的方法，如利用酶和抗体之间的亲和性、酶和金属离子形成复合物、通过酶分子上的糖基部分固定化、用分子生物学方法使酶定向固定化等。本章目录目前四十八页\总数一百三十五页\编于十七点5.4固定化酶的特性：1.固定化后酶活力的改变2.固定化对酶稳定性的影响3.固定化酶的最适温度变化4.固定化酶的最适pH变化5.固定化酶的专一性变化目前四十九页\总数一百三十五页\编于十七点游离的酶经固定化后，酶本身的结构会受到影响。由于它的催化作用由均相转到非均相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体的分配效应等因素必然影响到酶的性质。目前五十页\总数一百三十五页\编于十七点1.固定化后酶活力的改变在多数情况下，酶固定化后的活力比天然酶小，其专一性也会发生改变。例如，用羧甲基纤维素做载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30％，而对低分子底物苯酞精氨酸—对硝基酰替苯胺的活力保持80％。目前五十一页\总数一百三十五页\编于十七点所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。目前五十二页\总数一百三十五页\编于十七点在相同测定条件下，固定化酶的活力低于等摩尔原酶的活力，其原因可能是：目前五十三页\总数一百三十五页\编于十七点①酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；②固定化后，酶分子空间自由度受到限制(空间位阻)，会直接影响到活性中心对底物的定位作用；目前五十四页\总数一百三十五页\编于十七点③内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。目前五十五页\总数一百三十五页\编于十七点不过也有例外，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶的稳定性。目前五十六页\总数一百三十五页\编于十七点2.固定化对酶稳定性的影响稳定性关系到固定化酶能否实际应用。在大多数情况下，酶经过固定化后其稳定性都有所增加，这是十分有利的。具体表现在以下三个方面：目前五十七页\总数一百三十五页\编于十七点（1）热稳定性提高

作为生物催化剂，酶也和普通化学催化剂一样，温度越高，反应速度越快。但是大多数酶是蛋白质组成的，一般对热不稳定。因此，不能在高温条件下进行反应，而固定化酶耐热性提高，使酶最适温度提高，酶催化反应能在较高温度下进行，加快反应速度，提高酶作用效率。目前五十八页\总数一百三十五页\编于十七点（2）对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高酶经过固定化后，提高了对各种有机溶剂的稳定性，使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。可以预计，今后固定化酶在有机合成中的应用会进一步发展。目前五十九页\总数一百三十五页\编于十七点（3）对pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高

固定化酶稳定性提高的原因可能有：①固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形；②酶活力的缓慢释放；③抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解。目前六十页\总数一百三十五页\编于十七点3.固定化酶的最适温度变化酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合体现。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。目前六十一页\总数一百三十五页\编于十七点4.固定化酶的最适pH变化酶的催化能力对外部环境特别是pH非常敏感。酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移。曲线偏移的原因是微环境表面电荷性质的影响。目前六十二页\总数一百三十五页\编于十七点一般说来，用带负电荷载体(阴离子聚合物)制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏高。目前六十三页\总数一百三十五页\编于十七点原因的解释这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液中阳离子，包括H+，使其附着于载体表面，结果使固定化酶扩散层H+浓度比周围的外部溶液高，即偏酸，这样外部溶液中的pH必须向碱性偏移，才能抵消微环境作用，使其表现出酶的最大活力。目前六十四页\总数一百三十五页\编于十七点反之，带正电荷载体(阳离子聚合物)制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏低。使用带正电荷的载体其最适pH向酸性偏移。目前六十五页\总数一百三十五页\编于十七点5.固定化酶的专一性变化固定化酶的底物特异性与游离酶可能不同，其变化与底物相对分子质量的大小有关。作用于低分子底物的酶，专一性没有明显变化。既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，其专一性往往会有变化。专一性的改变，是由于空间位阻作用引起的。目前六十六页\总数一百三十五页\编于十七点由于静电作用，与载体电荷性质相反的底物在固定化酶微环境中的浓度比整体溶液中的高，与溶液酶相比，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值；而载体与底物电荷相同，则会造成固定化酶的表观Km值显著增加。目前六十七页\总数一百三十五页\编于十七点由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。这种Km变化又受溶液中离子强度影响。离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。本章目录目前六十八页\总数一百三十五页\编于十七点乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—AlaAminoacylase

氨基酰化酶5.5固定化酶的应用世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60％左右。目前六十九页\总数一百三十五页\编于十七点高果糖浆的生产世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶的放线菌细胞用60～65℃热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。目前七十页\总数一百三十五页\编于十七点酶传感器酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的，其中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。最常用的酶传感器是酶电极，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。目前七十一页\总数一百三十五页\编于十七点酶电极酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析。酶电极一般可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者一般有氧电极、H2O2电极等，后者有NH3、CO2、H2电极等。较典型的一种酶电极为葡萄糖酶电极。目前七十二页\总数一百三十五页\编于十七点葡萄糖酶电极结构示意图

葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。

目前七十三页\总数一百三十五页\编于十七点手掌型葡萄糖(glucose)分析仪目前七十四页\总数一百三十五页\编于十七点脲电极Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电极感应。此外还有： 氨基酸电极 醇电极 尿酸电极 乳酸电极 青霉素电极 亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3目前七十五页\总数一百三十五页\编于十七点一些常见的酶电极底物酶电极5′－腺苷酸5′－腺苷酸脱氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脱氢酶Pt过氧化物过氧化氢酶Pt(O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt(O2)D-氨基酸D－氨基酸氧化酶NH4+L-氨基酸L－氨基酸氧化酶NH3蔗糖蔗糖酶+葡萄糖氧化酶Pt(H2O2)琥珀酸琥珀酸脱氢酶Pt(O2)硫酸酯芳基硫酸酯酶Pt硫氰酸硫氰酸酶CN－硝酸盐硝酸盐还原酶/亚硝酸盐还原酶NH4+亚硝酸盐亚硝酸盐还原酶NH3（气体）草酸草酸脱羧酶CO2（气体）青霉素青霉素酶pH乳酸乳酸脱氢酶；细胞色素bPt，Fe（CN）-4L－氨基酸脱羧酶CO2L－精氨酸精氨酸酶NH4+L－天冬酰胺天冬酰胺酶NH4+本章目录目前七十六页\总数一百三十五页\编于十七点1、微生物、植物和动物细胞固定化5.6细胞和原生质体固定化目前七十七页\总数一百三十五页\编于十七点细胞特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um20-3001-1010-100倍增时间/h>120.3-6>15营养要求简单简单复杂光照要求大多数要光照不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗体、酶目前七十八页\总数一百三十五页\编于十七点固定化细胞培养技术利用物理或化学手段将游离细胞限制于特定空间里或表面的培养技术。培养液可在细胞间流动，细胞将产物分泌到培养液中，不需破碎细胞即可源源不断地从培养液中获得所需成分。目前七十九页\总数一百三十五页\编于十七点原理：密集而有一定程度分化的、生长缓慢的细胞能比分散而无结构的、生长迅速的细胞积累更多的次生代谢产物目前八十页\总数一百三十五页\编于十七点优点——与悬浮培养相比可以消除或极大地减弱营养液流动引起的切变力细胞生长缓慢，使次级代谢物（对人类有用）的产量增高，高产的固定化细胞的生物合成能力可达游离细胞的100倍目前八十一页\总数一百三十五页\编于十七点固定化之后使细胞间的接触紧密，气体和营养供应形成梯度，细胞有如在生物体组织中，有利于次生代谢进行通过培养液的循环供应，一方面可以保障细胞的营养需要；另一方面可以避免由于代谢产物的积累而对细胞代谢造成反馈抑制优点——与悬浮培养相比目前八十二页\总数一百三十五页\编于十七点便于操作培养基的组分和比例——次生代谢产物产量调节较成批培养简单：避免细胞受损和污染容易建立化学和物理上的梯度优点——与悬浮培养相比目前八十三页\总数一百三十五页\编于十七点便于次生代谢物的收集外分泌型细胞：直接在培养基中收集产物内分泌型细胞：通过化学诱导使其释放产物到培养液中消除产物对代谢的反馈抑制作用，将产量提高到最大程度优点——与悬浮培养相比目前八十四页\总数一百三十五页\编于十七点缺点必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。目前八十五页\总数一百三十五页\编于十七点一、植物细胞固定化培养技术目前八十六页\总数一百三十五页\编于十七点1、植物细胞固定化在植物细胞培养方法中，该法是最新的培养技术，而且是一种最接近自然状态下的培养方法固定化的结果：促使细胞以多细胞状态或局部组织状态一起生长，且细胞处于静止状态，所建立起来的物理和化学因子梯度能提供一种最接近细胞体内状态的环境目前八十七页\总数一百三十五页\编于十七点优点研究发现生长迅速且松散的细胞其次生代谢物积累水平极低，主要为初级代谢产物而聚集的或部分组织化的细胞所积累的次生代谢产物要比生长迅速而松散的细胞高目前八十八页\总数一百三十五页\编于十七点聚集化和组织化的作用培养细胞的组织化水平越接近整体植株水平，就越能以整体植株相同的方式对环境因子的刺激起反应聚集的细胞其生长速度低于游离的悬浮培养细胞，且生长速度的降低与次级代谢物产量的提高之间有正相关性目前八十九页\总数一百三十五页\编于十七点2、植物细胞的固定化方法根据细胞的种类、大小和特性的不同，选择不同的固定化方法主要分吸附法和包埋法两类吸附法——吸附在固体吸附剂表面包埋法——包埋在多孔载体内部共价结合法和交联法目前九十页\总数一百三十五页\编于十七点2.1吸附法使用固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料的大孔隙或裂缝中中空纤维的外壁例如将多孔陶瓷颗粒洗净和灭菌后置悬浮细胞中进行振荡培养，一段时间后细胞就会吸附在多孔陶瓷的孔洞内，并在其中生长繁殖和新陈代谢目前九十一页\总数一百三十五页\编于十七点根据吸附剂的特点分:1）物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氢键、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等2）离子结合法（ionbinding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素目前九十二页\总数一百三十五页\编于十七点中空纤维固定植物细胞将植物细胞定置于中空纤维的外壁和外壳容器的内壁之间培养液及气体在中空纤维的管内流动，各种营养成分和溶解氧通过中空纤维的半透膜管壁传递给外壁的细胞细胞的代谢产物又通过中空纤维膜分布到管内培养液中，并随培养液流出目前九十三页\总数一百三十五页\编于十七点聚丙烯中空纤维膜目前九十四页\总数一百三十五页\编于十七点此法近似于植物体内物质的传递与交换形式，有利于细胞生长和新陈代谢的进行中空纤维作为固定化载体的缺点有时纤维管会阻塞而影响物质传递中空纤维成本较高，难以大规模生产利用目前九十五页\总数一百三十五页\编于十七点吸附法优缺点操作简便易行对细胞的生长、繁殖和新陈代谢没有明显的影响吸附力较弱、吸附不牢固细胞容易脱落，使用受到一定的限制目前九十六页\总数一百三十五页\编于十七点2.2包埋法将细胞包埋在多孔载体内部凝胶包埋法以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法。细胞经包埋固定后，被限制在凝胶的微孔内进行生长、繁殖和新陈代谢半透膜包埋法目前九十七页\总数一百三十五页\编于十七点凝胶包埋法应用最广泛适用于各种植物细胞、动物细胞和微生物细胞使用的载体海藻酸钙凝胶、角叉才胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂、琼脂等目前九十八页\总数一百三十五页\编于十七点①琼脂凝胶包埋法目前九十九页\总数一百三十五页\编于十七点也可将琼脂细胞混悬液摊成薄层，待其冷却凝固后，在无菌条件下，将固定化细胞胶层切成所需的形状缺点琼脂糖凝胶的机械强度较差氧气、底物和产物的扩散比较困难应用受限目前一百页\总数一百三十五页\编于十七点细胞工程黄林彬琼脂凝胶目前一百零一页\总数一百三十五页\编于十七点②海藻酸钙凝胶包埋法目前一百零二页\总数一百三十五页\编于十七点操作简便、条件温和、对细胞无毒性通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合多种细胞的固定化磷酸盐（营养液中）会破坏凝胶的结构，应控制好其浓度在营养液中保持一定浓度的钙离子，维持凝胶结构的稳定性目前一百零三页\总数一百三十五页\编于十七点海藻酸钙凝胶目前一百零四页\总数一百三十五页\编于十七点③角叉菜胶包埋法溶解、灭菌、冷却到35-50℃与细胞悬浮液混匀后滴到预冷的氯化钾溶液中，制成小球状固定化细胞胶粒也可按需制成片状或其它形状凝聚成型时可使用其它阳离子，如NH4+、Ca2+等目前一百零五页\总数一百三十五页\编于十七点角叉菜胶具有一定的凝胶强度、对细胞无毒害通透性较好，是一种良好的固定化载体应用广泛目前一百零六页\总数一百三十五页\编于十七点④明胶包埋法明胶是一种蛋白质，易受蛋白酶的分解高压蒸汽灭菌，105℃，1.05MPa，15分钟冷却至35℃以上目前一百零七页\总数一百三十五页\编于十七点⑤聚丙烯酰胺凝胶包埋法目前一百零八页\总数一百三十五页\编于十七点目前一百零九页\总数一百三十五页\编于十七点机械强度高，孔径与丙烯酰胺浓度相关但丙烯酰胺单体对细胞有一定的毒害作用，应尽量缩短聚合时间目前一百一十页\总数一百三十五页\编于十七点⑥光交联树脂包埋法在光的作用下分子间发生交联反应，生成不溶性网状聚合物——光交联树脂作用原理：在一定波长的光引发下，带有可以发生光交联反应官能团高分子之间发生加成性交联聚合反应，生成不溶性交联产物为了增加光敏感范围，此类树脂在使用时有时需要加入光敏化剂目前一百一十一页\总数一百三十五页\编于十七点固定过程目前一百一十二页\总数一百三十五页\编于十七点不同分子量的预聚物形成不同孔径的树脂，适合多种不同直径的细胞固定光交联树脂的强度高，可连续使用较长的时间用紫外光照射几分钟就可完成固定化，时间短对细胞的生长繁殖和新陈代谢没有明显影响目前一百一十三页\总数一百三十五页\编于十七点半透膜包埋半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内半透膜：直径几十微米到几百微米厚约25nm植物细胞孔径>半透膜孔径小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”目前一百一十四页\总数一百三十五页\编于十七点2.3共价结合法细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而形成为固定化细胞细胞与载体结合紧密，不易脱落；但制备较难，且活力损失较大目前一百一十五页\总数一百三十五页\编于十七点载体：亲水载体优于疏水载体天然高分子衍生物:

纤维素葡聚糖凝胶亲和性好，机械性能差琼脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯机械性能好，但有疏水结构尼龙目前一百一十六页\总数一百三十五页\编于十七点2.4交联法利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团（如氨基酸、羟基、咪唑基等）发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键此法制备麻烦，活力损失较大；但细胞与载体结合较紧目前一百一十七页\总数一百三十五页\编于十七点3、固定化植物细胞的特点与悬浮培养相比有以下特点：植物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可减轻剪切力和其它外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率和稳定性细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团目前一百一十八页\总数一百三十五页\编于十七点固定化植物细胞培养可以简便地在不同的培养阶段更换不同的培养液首先在生长培养液中生长增殖，在达到一定的细胞密度后，改换成发酵培养液，以利于生产各种所需的次级代谢物目前一百一十九页\总数一百三十五页\编于十七点固定化植物细胞可反复使用或连续使用一段较长的时间，大大缩短生产周期，提高产率固定化植物细胞易与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量目前一百二十页\总数一百三十五页\编于十七点注意事项为了长期利用，需要防止固定化细胞过度生长措施采用有限度的营养培养基改变培养基的激素浓度，限制其生长否则会引起渗漏或