流式细胞仪操作规程-SOP

流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测3：HLA-B27测定4：CD55／CD59测定5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定7：淋巴细胞T细胞亚群细胞因子IFN-γ/IL-4测定8：细胞周期分析9：活化血小板检测10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：淋巴细胞亚群测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体参加到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤〔和固定〕等步骤后，在流式细胞仪上进展分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，参加Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞外表抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，参加Flow-Count组会自动得出绝对计数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量1ml。2．样本应在采集后6小时处理，冷冻或溶血的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。假设>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；假设<4.0×109/L，应别离单个核细胞。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体2—8℃(CD45/4/8/3No.6607013CD45/56/19/3No.6607073CD4/8/3No.IM1650同型对照IgG1/IgG1/IgG1No.IM1672CD3/19No.IM1293CD3/16+56No.IM2076CD19-PC5No.IM2643Flow-Count荧光微球No.7547053)2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(OptilyseCNo.IM1401)液体室温3：鞘液(No.8546859)液体20L室温4：清洗液(No.8546930)液体5L室温5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICS*L/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中参加10/20ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中参加混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进展溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进展下一个样品测定。〔*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体〕5)上机测样〔可根据样本情况选择洗或不洗上样〕6)需要做绝对计数的指标，在相应管中参加与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机)报告结果报告百分数〔和绝对值〕操作性能精细度批五次重复CV<2％参考值(百分数〔绝对值〕)CD3+60.8-75.4%(1141-1880)CD4+29.4-45.8%(478-1072)CD8+18.2-32.8%(393-742)NK9.5-23.5%(175-567)1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。点击点击点击点击4色3色点击点击填写Flow-Count的浓度填写Flow-Count的浓度活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体参加到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤〔和固定〕等步骤后，在流式细胞仪上进展分析，从而得到相应各亚群的百分数。活化淋巴细胞外表抗原为CD3+/CD25+和CD3+/HLA-DR+。CD3+/CD45RO+是记忆型T细胞。CD3+/CD45RA+是纯真型T细胞。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量1ml。2．样本应在采集后6小时处理，冷冻或溶血的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。假设>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；假设<4.0×109/L，应别离单个核细胞。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体2—8℃(CD3/HLA-DRNo.IM1295CD25-PC5No.IM2646CD3-FITo.IM1281CD45RA-PENo.IM1834CD45RO-PENo.IM1307CD4-PC5No.IM2636〕2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(OptilyseCNo.IM1401)液体室温3：鞘液(No.8546859)液体20L室温4：清洗液(No.8546930)液体5L室温5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICS*L/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中参加10/20ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中参加混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进展溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进展下一个样品测定。〔*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体〕5)上机测样〔可根据样本情况选择洗或不洗上样〕报告结果报告百分数操作性能精细度批五次重复CV<2％参考值(百分数)CD3+/HLA-DR+3.1±1.3%CD3+/CD25+15.9±3.7%CD3+/CD45RO+3.3±1.55%CD3+/CD45RA+/CD4+20.51±3.64%1.HLA-DR、CD25、CD69是T细胞活化各个时期表达的标志性抗原，对其进展检测可以判断出疾病的进程，有助于临床疾病的辅助诊断、预后和治疗。如活化状态的监测是对机体移植免疫状况判断的最主要依据，有助于临床选择治疗方案，CD25+/CD3+>5-10%提示排斥、持续增加提示应作病理活检；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。.正常机体各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例，如果它们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱，将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的发生，检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗。CD45RA、CD45RO均为T细胞的辅助分子，CD45RA+纯真型T细胞当免疫力下降时减少；CD45RO+记忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感染疾病中减少。方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE单克隆抗体参加到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤〔和固定〕等步骤后，在流式细胞仪上进展分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量1ml。2．样本应在采集后6小时处理，冷冻的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。假设>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；假设<4.0×109/L，应别离单个核细胞。4．溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体1ML2—8℃(HLA-B27/HLA-B7No.IM1502同型对照IgG1／IgG2aNo.IM1389))2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8℃质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进展校准。仪器BeckmanCoulterEPICS*L/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中参加20ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC／IgG1-PE)2)分别向试管中参加混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进展溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进展下一个样品测定。〔*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体〕5)洗、离心、上机测样〔备注：测B27一定要至少洗一遍方可上机检测〕报告结果报告阴阳性操作性能精细度批五次重复CV<2％参考值阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在5.0以上，阳性率>90%。HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。HLA-B27基因属于І型MHC基因，所有有核细胞上均有表达，尤其是淋巴细胞外表含量丰富，人们发现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性，超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表达阳性，而正常人群中仅5-10%的认为阳性。由于强直性脊柱炎病症与许多疾病相类似，临床上难以确诊，因此HLA-B27检测在疾病的诊断中具有重要意义，HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴别诊断中的一个重要指标。点击点击点击点击键入文件名，点击Save2.画图方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法。近年的研究说明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量1ml。2．样本应在采集后6小时处理，冷冻的标本不能用。3．溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体1ML2—8℃(CD59-FITCNo.IM3457CD55-PENo.IM2726)2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8℃质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进展校准。仪器BeckmanCoulterEPICS*L/FC500/Altra样本制备:(一)白细胞CD55／CD59检测1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中参加样品100ul。2．溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进展溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进展下一个样品测定。〔*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体〕3．离心后分别参加CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。4．洗涤离心5．上机测样(二)红细胞CD55／CD59检测1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记2．分别参加CD55／CD5910ul和相应的同型对照10ul。3．向二管中参加1：200稀释的样品100ul〔可根据红细胞的数量调整〕，避光20-30分钟。4．洗涤离心。5．混匀、上机测样。报告结果报告百分数操作性能精细度批五次重复CV<2％参考值CD55>97%CD59>97%PNH的临界值：RBCCD59>95%WBCCD59>90%PNH的诊断值：RBCCD59>91%大局部>80%中性粒细胞CD59>84%用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。3.WBC干细胞检测和绝对计数方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体参加到全血中，与干细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤〔和固定〕等步骤后，在流式细胞仪上进展分析，从而得到百分数，参加Flow-Count即可得出绝对计数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量1ml。2．样本应在采集后6小时处理，冷冻或溶血的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。假设>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；假设<4.0×109/L，应别离单个核细胞。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体2—8℃(CD34No.IM1871CD45-PC5No.IM2653/IM2652Flow-Count荧光微球No.7547053)2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(OptilyseCNo.IM1401)液体室温3：鞘液(No.8546859)液体20L室温4：清洗液(No.8546930)液体5L室温5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICS*L/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中参加10ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中参加混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进展溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进展下一个样品测定。〔*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体〕5)需要做绝对计数时，在相应管中参加与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机)6)上机测样报告结果报告百分数〔和绝对值〕操作性能精细度批五次重复CV<2％参考值(百分数〔绝对值〕)CD34+/CD45+0.58±0.29%目前把CD34作为造血干细胞的主要标志，CD34阳性细胞计数作为造血干细胞水平定量的检测方法。方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体参加到全血中，与细胞膜上或膜相应的抗原结合，经过溶血、洗涤〔和固定〕等步骤后，在流式细胞仪上进展分析，从而得到百分数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位骨髓采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝要求1．样本量1ml。2．样本应在采集后6小时处理，冷冻或溶血的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。假设>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；假设<4.0×109/L，应别离单个核细胞。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体2—8℃(CD34No.IM1871CD45-PC5No.IM2653/IM2652Flow-Count荧光微球No.7547053)2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(OptilyseCNo.IM1401)液体室温3：鞘液(No.8546859)液体20L室温4：清洗液(No.8546930)液体5L室温5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICS*L/FC500/Altra操作-样本制备细胞膜外表抗原1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲参加的抗体。2．首先每管中参加5ulCD45-PC5抗体。3．然后，按管上的标记，参加相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)4．各管中参加标本(骨髓或外周血)30～100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光20～30分钟。5．溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQ—PREP制备系统开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进展溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进展下一个样品测定。〔*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体〕细胞浆和核抗原1．准备所需的管，并在管上标记上欲参加的抗体，其中一管是同型对照。2．首先每管中参加标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。3．每管中参加固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。4．各管中参加PBS4ml。5．300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)6．各管中参加透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。7．加抗体，阴性对照管中参加10ul，其余各管参加相应抗体各10ul，室温避光15分钟。8．各管中参加4mlPBS，振荡混匀。9．300g离心5分钟后，弃去上清液。10．各管中参加PBS500ul，振荡混匀。11．上机测样报告结果报告百分数操作性能精细度批五次重复CV<2％参考值CD34+<5%MPO+<5%粒系<20%淋系<30%用于血液病的诊断和分型诊断T细胞亚群细胞因子IFN-γ/IL-4检测方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞滞留到一定的量)，然后进展细胞膜外表抗原和细胞细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞的IFN-γ和IL-4进展测定。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂肝素抗凝血要求1．样本量至少1ml。2．样本应在采集后6小时处理，冷冻的标本不能用。3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。假设>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；假设<4.0×109/L，应别离单个核细胞。4．溶血样本不能用。试剂淋巴细胞培养体系(自配)成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。选白美国SIGMA公司。单克隆抗体(BeckmanCoulter公司)CD4-PC5(No.IM2636)、IL-4-PE(No.IM2719)、IFN-γ-FITC(No.IM2716)。质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进展校准。仪器BeckmanCoulterEPICS*L/FC500/Altra操作：细胞培养与染色取200ul抗凝血参加lOulCD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞参加培养体系中，5％C0237℃孵育18小时，取出后以PBS洗一次。用专用细胞因子试剂进展细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一为测定管参加lOul抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC，另一管参加同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。流式细胞仪测定翻开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。●淋巴细胞在FS／SSC散点图中位置，即A门细胞；●A门CD4阳性细胞，即B门细胞；●B门TH细胞亚群分布：1区数值---Th1细胞(%)4区数值---Th2细胞(%)2区数值---Th0细胞(%)报告结果报告百分数操作性能精细度批五次重复CV<2％正常参考值Thl(IFN-γ)：17.39±5.52%Th2(IL-4)：1.50±0.44%ThO：0.51±0.26%淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-γ和TNF-b／a等，Th2细胞主要分泌IL-4．IL-5．IL-6，IFN-γ为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN-γ+，Th2为IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞的IFN-γ和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-γ和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反响能力。细胞周期分析方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量标本采集与处理检测对象实体〔肿瘤〕组织、灌洗液、石蜡块、培养细胞要求1．实体〔肿瘤〕组织、灌洗液和培养细胞如果不能立即做应用冷乙醇固定，－20℃可保存2－3个月，－70℃可保存半年以上。2．样本计数应在1.0×106/ml试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：DNA-Prep试剂系统液体2—8℃〔No.6607055〕〔包括DNA-PrepLPR和DNA-Prep染料〕2：鞘液(No.8546859)液体20L室温3：清洗液(No.8546930)液体5L室温4：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICS*L/FC500/Altra样本制备：灌洗液或培养细胞PBS洗，稀释为1.0×106/ml，取100ul,参加DNA-PrepLPR10秒后参加DNA-Prep染料1ml,室温避光15分钟。过300目滤网，上机检测。实体〔肿瘤〕组织单细胞悬液制备：将固定或新鲜的组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。〔如果是淋巴瘤只需用生理盐水冲即可〕。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，以500－800转离心沉淀2分钟。染色：同上上机检测石蜡块脱蜡水化：石蜡块切成50um厚，3－5片，放入二甲苯中室温放置24小时，更换二甲苯室温再置24小时。取出加无水乙醇10分钟，依次加95％乙醇、70％乙醇、50％乙醇及双蒸水各10分钟。单细胞悬液制备及染色：同上上机检测报告结果报告各期的百分数操作性能精细度批五次重复CV<2％参考值DNA倍体分析用于肿瘤早期诊断、良恶性肿瘤判断、肿瘤预后、治疗方案的选择，正常组织和良性肿瘤DNA均为二倍体，恶性肿瘤时则出现异倍体。方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：间接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤〔和固定〕等步骤后，在流式细胞仪上进展分析。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量2ml。2．样本应在采集后6小时完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。3．样本血小板计数应在150-450×109/L之间。假设>450×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；假设<150×109/L，应多采集进展富集到达流式检测的细胞数。4．溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：一抗冻干0.2mg-20℃小鼠抗IgD(No.IM0284)IgG(No.IM0279)IgM(No.IM0285)二抗：山羊抗小鼠IgG(H+L)(No.IM0819)冻干1mg-20℃2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8℃质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进展校准。仪器BeckmanCoulterEPICS*L/FC500/Altra操作：富集血小板法：1〕800r/min*15min,取上清，2〕加4－5ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。3)分别向试管中参加准备好的10u1含血小板的PBS〔血小板的量约为106〕〔血小板假设在正常围，稀释到原量直接取10u1。〕。4)分别向已编好号的试管中依次参加一抗和二抗〔设对照〕5)混匀，避光，室温孵育20-30分钟6)洗或不洗，上机测样全血法：1〕加4－5ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3〕－6〕报告结果报告百分数操作性能精细度批五次重复CV<2％参考值IgA<2.98%IgG<3.04%IgM<3.0%IgD<2.91%为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。〔红细胞抗体〕方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进展分析。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量1ml。2．样本应在采集后6小时处理，冷冻的标本不能用。3．溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：一抗冻干0.2mg-20℃小鼠抗IgD(No.IM0284)IgG(No.IM0279)IgM(No.IM0285)二抗：山羊抗小鼠IgG(H+L)(No.IM0819)冻干1mg-20℃2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L