第十二讲蛋白质分子设计

一、蛋白质分子设计的概念和意义1、概念实现蛋白质分子改造目标的一整套方法、计划、措施和指导方针。以蛋白质结构和功能的关系为基础，通过蛋白质模型和结构预测等方法，构建具有新功能的蛋白质模型的技术。如何理解？分子设计包括：目标、思想、程序、方法、措施、验证和分析一系列过程。是蓝图—如：建筑工程的设计蓝图—宏伟构思和诱人的前景是理论—理论上的设计——指导实践过程是实践—实践上的验证——提出问题与建筑工程的蓝图不同——实施验收(也有豆腐渣工程——不是设计的问题)是设计—实践—验证—再设计—再实践—再验证的过程是一个设计—验证反复进行的过程。获得新功能蛋白质分子及其分子模型2、意义：（通过分子设计、人工改造蛋白）理论上：解析蛋白质结构和功能关系实践上：满足生产实践的需求目前一页\总数三十页\编于十七点蛋白质分子设计是蛋白质工程领域的核心问题与前沿领域是一门新兴的研究领域，是众多学科的交叉结构生物学、信息生物学、分子生物学、蛋白质化学、细胞生物学、免疫学等随其他学科的发展而不断地发展，其内容也在不断地更新。设计和实践成功的实例：DNA结合蛋白、血红素结合蛋白、氧化还原活性蛋白理论上：解析蛋白质结构和功能关系？为什么组成天然蛋白质只20种氨基酸， 却具有高度多样性，功能如此广泛又各不相同？？蛋白质一级结构与高级结构的关系？？蛋白质高级结构与功能的关系？？蛋白质一级结构与功能的关系？2、意义——理论上：目前二页\总数三十页\编于十七点天然蛋白的缺陷生物进化过程中，自然选择了数量众多、种类各异的天然蛋白质。天然蛋白质在特定的条件下应用，(适合于生物环境)改造蛋白的优势工业生产—高温高压条件，其结构和功能改变，达不到理想的效果。 为了更好地发挥蛋白质的作用，需要对蛋白质进行人为改造。如：药物、食品工业和污水处理中的酶、疫苗、生物传感器等进行蛋白分子设计改造，发挥良好的作用。如：经改造稳定性好的酶，可从价格便宜的棕榈油中生产出价格昂贵的可可脂，创造很高的经济效益。2、意义——实践上：目前三页\总数三十页\编于十七点如：荷兰一家公司设计了一种与漂白剂一同起作用的去污酶（对酶上两个氨基酸修改，使这种酶具有较高抵抗力），在洗涤过程中不受破坏。如：医学上，蛋白质工程也具有广泛的应用前景。比如，用人工手段去改造蛋白质，开辟了诊断和治疗癌症的新途径。 单链抗体—核素——免疫影像？ 单链抗体—毒素——免疫治疗？我国的蛋白质工程达到国际先进水平，如：重组人胰岛素和溶血栓药物、重组人尿激酶等。对这些蛋白质改造离不开蛋白质分子设计。因此，蛋白质分子设计在生产实践中具有重要意义目前四页\总数三十页\编于十七点二、蛋白质设计的分类包括两种分类方式1、根据对蛋白质改造的程度分为三类第一类为“小改”，即通过定位突变或化学修饰来实现；第二类为“中改”，即不同蛋白质的结构域进行拼接组装，改变蛋白质的功能特性的方法；——如：蛋白质融合技术实现第三类为“大改”，即全新设计具有特定功能的蛋白质——仿生2、根据改造对象分为两类基于天然蛋白质结构的分子设计全新蛋白质的分子设计3、两种分类方法是统一的目前五页\总数三十页\编于十七点三、蛋白质设计的基础理解（一级结构—高级结构—功能的关系）——蛋白质分子设计的基础理解结构是功能的基础——蛋白质独特的性质和功能是其特定结构的反映。1、蛋白质一级结构是空间结构的基础（理解2点）每一种天然蛋白质生物学活性，决定于蛋白质的结构特点20种aa各具特殊的侧链，侧链基团的理化性质和空间排布各不相同，可形成多种多样的空间结构，具有不同生物学活性。一级结构不同，蛋白质功能和活性存在差异，甚至完全不同。每种蛋白质具有特定的结构，执行其特定的功能甚至一级结构上个别aa变化→特定功能的丧失或改变。最经典的例子：镰刀型红细胞贫血病，即患者Hb2条β链第6位Glu→Val蛋白酶：个别aa突变（关键aa），酶活性丧失*要求：查找一级结构中个别氨基酸突变蛋白，功能改变的实例目前六页\总数三十页\编于十七点2、蛋白质空间结构直接决定蛋白质的功能一级结构不能完全了解蛋白质分子的生物学活性和理化性质多肽链并非呈线形伸展，而是折叠和盘曲构成特有的稳定的空间结构蛋白质的生物学活性和理化性质主要决定于空间结构的完整性 ？去折叠——变性，一级结构未发生改变—功能完全丧失—空间结构的作用 ？蛋白质去折叠的方法——物理、化学因子蛋白的性质和功能，很难仅用蛋白质的一级结构的排列顺序来解释理解蛋白空间结构和功能关系对蛋白质分子设计才是最重要的蛋白质一级结构——高级结构——功能关系，是蛋白质分子设计的基础目前七页\总数三十页\编于十七点蛋白质分子设计面临的挑战虽然解析蛋白质的结构逐年增加，但依然无法满足蛋白质分子设计的需要？现有蛋白质的分子设计大多数主要依据一级结构。——一次性成功的把握很小？目前八页\总数三十页\编于十七点四、蛋白质分子设计的流程蛋白质分子设计——庞大工程蛋白质分子设计程序构建原蛋白质模型建立和优化突变体模型获得蛋白质的突变体结构和功能分析验证新的结构和功能的蛋白质通常，需要几次循环才能达到目的蛋白质分子设计流程需要计算机专家、X射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家相互配合需要理论设计和试验过程相结合，才能达到改造蛋白质的目的。目前九页\总数三十页\编于十七点目前十页\总数三十页\编于十七点1、设计构建蛋白质突变体模型收集素材——构建原蛋白质模型：掌握和了解蛋白质的一级结构、高级结构、功能域，理化特性、 结构和功能的关系、以及同源蛋白的相关信息。数据来源：查阅文献和相关数据库。对于已知结构蛋白质，同源建模法或直接构建模型。未知结构的蛋白质，要么先解析其晶体结构，要么根据已知的氨基酸序列进行结构预测。设计突变体——建立突变体模型——借鉴现有的经验（规则）改变蛋白质结构：优化蛋白的稳定性、抗氧化性、对重金属稳定性、pH稳定性、酶学性质如：Hartley等（1986年）完成有关蛋白质一些重要性质的设计目标及解决办法表具有一定的参考价值。（Next）考虑不同氨基酸对蛋白质二级结构的影响（第七讲结构预测）Chou和Fasman对29种蛋白一级结构和二级结构之间的关系进行统计分析，发现：a—螺旋最强生成者：Glu、Met、Ala、Leu；最强破坏者：Gly、Pro；β-折叠最强生成者：Gly、Ala、Ser；β-转角最强生成者：Gly、Pro、Asp、Ser；最强破坏者：Ile、Val、Leu。目前十一页\总数三十页\编于十七点蛋白质重要性质设计目标及解决办法 设计目标 解决办法Hartleyetal.（1986）思考：为什么能改善蛋白性质目前十二页\总数三十页\编于十七点2、建立和优化突变体模型（能量优化以及蛋白质动力学分析）利用能量优化以及蛋白质动力学分析的方法——预测修饰后的蛋白质的结构将预测结构与原始蛋白质的结构比较利用蛋白质结构—功能或结构—稳定性相关知识预测新蛋白可能具有的性质和功能目前十三页\总数三十页\编于十七点3、获得蛋白质突变体蛋白质分子设计仅停留在理论层面上，没有试验证据，这种设计是没有任何意义的。根据设计，合成蛋白质，或改造蛋白质突变体的基因序列，表达突变体蛋白，然后分离、纯化得到所要求的蛋白质。获得突变体的方法和手段（详见：蛋白质纯化与克隆修饰）分子生物学方法：获得基因、定点突变、导入宿主细胞、表达基因的产物—蛋白质分离纯化：采用分离纯化的方法—分离突变蛋白质—测试→目前十四页\总数三十页\编于十七点4、结构和功能分析——蛋白质分子设计的流程对纯化的蛋白质突变体进行结构和功能的分析和测试，与原蛋白质比较，是否达到预期改造的目的。若得到的蛋白质突变体没有实现预期的功能，则需要重新设计和改造；若达到预期，则获得一种具有特定功能的新蛋白。蛋白质分子设计是一门试验性科学，是理论设计过程与实验过程相结合的产物。理论设计与实验过程两部分相辅相成，才构成了蛋白质分子设计的全过程。再深入理解：（符合认识论的过程——实践—认识—再实践—再认识的过程）学习与知识（知—识）的应用过程（掌握规律、利用规律、改造自然、做自然的主人）遇到问题、思考问题、采取对策、解决问题的过程做一个实验：设计—实验—再设计—再实验任何事情：仅仅停留在理论层面上是毫无意义的!认识具有能动性意识对物质具有反作用只要精神不滑坡，办法总比问题多体会——深刻理解：试验性科学=理论设计+实验验证目前十五页\总数三十页\编于十七点（一）获得原蛋白质的结构与功能信息 一级和高级结构、功能结构域、同源蛋白、基因、理化性质

（二）建立原蛋白分子的结构模型（原蛋白结构模型）模型来源：PDB或文献实验测试三维结构—衍射、NMR……预测：如：同源蛋白进行三维结构预测

（三）结构模型信息分析结构特点——模体——结构域功能活性区域及分布影响因素二硫键数目和位置（四）选择设计目标（依据和实践经验） （确定突变位点或序列，功能区二硫键数目和位置）五、设计思路（9个步骤）目前十六页\总数三十页\编于十七点（五）突变体（序列）设计设计的原则 1.充分考虑氨基酸的极性，以利于形成特定的空间结构

α-螺旋（LeuGlu），β-折叠（ValIle），β-转角（ProGlyAsn) 2.充分考虑氨基酸的排列顺序，以利于形成次级键构成空间结构设计的基本方法（下周详细讲述）序列最简化法：少数几个氨基酸设计的序列，往往具有一定的对称性和周期性，从而减少设计的复杂性，并能检测到一些蛋白质折叠的规律和方式。模板组装合成法：将各种二级结构片段通过共价键连接到一个刚性的模板分子上，形成一定的三级结构。绕过了蛋白质三级结构中的氨基酸残基来研究蛋白质中长程作用力，是研究蛋白质折叠和进行蛋白质全新设计规律摸索的有效手段。目前十七页\总数三十页\编于十七点（六）构建和预测突变体模型→初步检验→修正设计结构模型二级结构预测方法：依据信息论和概率统计（ChouFasman法；Garnier方法；Cohen方法）三级结构预测方法和构象搜索方法：依据基团之间相互作用的能量最低原理研究者具备的素质：硬件（计算机软件、高质量立场）；软件（结构化学、物化和背景知识）；专业知识（七）获得新设计的蛋白质（合成新设计的蛋白质）多肽化学合成法（固相合成技术）获得新蛋白质基因工程手段：PCR等基因操作-构建突变体-表达-分离纯化-新蛋白质。（八）新蛋白质的检验是否有多聚态？是否与设计吻合？是否有三级结构？功能活性？（九）完成新蛋白质的设计反复设计—反复修改——反复试验→达到预期目标纸上谈兵成本低廉目前十八页\总数三十页\编于十七点本节小结1、蛋白质分子设计：通过蛋白质模型和结构预测来构建具有新功能的蛋白质2、分子设计分类：根据对蛋白质改造的程度、根据改造对象分为两类不同，蛋白质分子设计分为三类3、掌握蛋白质分子设计的程序 建模→优化→获得突变体→结构和功能分析4、掌握蛋白质设计思路（试验性科学=理论设计+实验过程）获得蛋白质结构与功能信息建立分子设计的结构模型结构模型信息分析选择设计目标突变序列设计预测结果→初步检验正确度→修正设计结构模型获得新蛋白质（合成新设计的蛋白质）新蛋白质的检验新一轮蛋白质的设计目前十九页\总数三十页\编于十七点第二节部分氨基酸的突变部分氨基酸的突变——又称“小改”，是基于对已知蛋白质的局部改造。是目前蛋白质工程中使用最广泛的方法。思路：设计目标分子→基因序列或cDNA序列→定点突变→载体系统→宿主细胞表达→特定改变的蛋白质分子→突变体与野生型蛋白性质比较目的：改变蛋白质的性质和提高蛋白质活性蛋白质的热稳定性、酸碱稳定性、增加活性、减少副作用、提高专一性阐明蛋白质的结构和功能的关系关键的问题：如何恰当地选择要突变的位点（aa残基）。解决问题的手段：通过蛋白分子设计——分析蛋白质中残基的性质，借助于已有的蛋白质三维结构或分子模型分析。（详见以下五方面阐述）目前二十页\总数三十页\编于十七点部分氨基酸改造——从以下五方面选择“突变”位点 ——针对不同的情况和目的，采取5种不同的改造方法根据结构信息确定突变的位点（碱基）随机突变缺失突变和接头分区突变根据蛋白质的同源性确定功能残基选择翻译后修饰位点突变目前二十一页\总数三十页\编于十七点一、根据结构信息确定突变位点已知高级结构的蛋白：（X射线晶体或NMR谱高分辨率）根据氨基酸残基在蛋白质结构上的位置来推测其功能。如果已知蛋白质及其配基复合体的结构（包括受体、底物、辅酶和抑制剂），——掌握了活性部分，对这些aa改造，这种方法则更有效。Why？与配基相互作用（形成氢键、离子键或疏水作用）的aa残基，根据其与配基基团的距离和取向而确定——突变哪个aa。用定点突变的方式替换这些残基，验证这些残基是否参与结合。这种方法是理解和证明——酶专一性和催化活性——基础。目前二十二页\总数三十页\编于十七点二、随机突变什么是？物理和化学诱变剂（射线照射、化学试剂）—突变株—如：E.coli定向进化技术？——体外随机突变技术优势：能非常容易地产生大量突变体。分析原则：—突变分析真正有功能的保守的氨基酸不能忍受各种类型的突变。如果突变，仅蛋白分子发生了结构的改变，没有破坏蛋白质的功能，则该突变位点的残基对结构和功能的维系可能不是很重要的。突变分析的目的：对突变蛋白分子进行分析，确定突变位点和功能的关系突变体制备缺乏控制，制备和分析大量突变体，才能获得可解释的数据如：不同位置上的氨基酸残基的几种不同的替换，究竟哪一个是特异性的替换——特异性地影响蛋白功能获得新的优良性质的蛋白质——掌握新蛋白结构和功能的关系缺点：需要获得大量的分析突变体，才能解释究竟哪一个突变是特异性。目前二十三页\总数三十页\编于十七点三、缺失突变分析和接头分区突变用能识别序列中多个位点的限制性内切酶消化基因，并分离各个片段。为了产生分散的缺失，在重新连接之前用外切核酸酶消化线性DNA。为了产生分散的插入，可以将合成DNA的小片段（接头）连接到切割位点上。通过重叠PCR方法，分别导入基因中缺失突变？基因中缺失1个或几个碱基造成的突变。接头分区突变？在整个基因各个位置上插入小量的核苷酸，观察蛋白质功能。用途：快速确定——基因编码序列长度；功能上重要的结构域。操作方法：利用经典的重组DNA技术，在体外很容易地构建。操作原理：转座子诱变也是其中的一种方式目前二十四页\总数三十页\编于十七点举例：基因调节区DNA序列重要元件的定位。如：HIV逆转录酶p66亚基（包括两个更小的亚基p51和p15），两个小亚基有什么作用呢？用接头插入突变分析。聚合酶功能位于N端，编码p51亚基，RNaseH功能则位于C端，编码pl5亚基。鉴定鼠和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)关键的活性区域。突变目的：了解基因的长度和不同区域的功能和作用快速扫描编码序列的长度并鉴定功能上重要的结构域，进一步以单一氨基酸替换的方法进行更精细的分析。目前二十五页\总数三十页\编于十七点四、利用蛋白质的同源性确定功能残基？：通过序列同源性比对分析，确定突变位点的方法。我们知道 每个残基的功能信息，能够通过比对分析不同种属的同源蛋白质的序列获得。两种假设——（用于定点突变技术分析蛋白质）同源蛋白结构域中：保守的残基和非保守的残基。保守残基可能参与相同功能，或者在维持相同结构中发挥关键作用。在同源蛋白质中差异很大的残基可能不重要，或者在蛋白质分子识别方面发挥重要作用。设计实验验证（假设）目前二十六页\总数三十页\编于十七点1、保守残基的突变——蛋白激酶家族基因分析，2个Asp完全保守，Brenner推测有重要作用，见下图。酵母菌突变验证，Ala替换Asp。替换Asp210，kcat下降300倍，而与底物结合的Km值则不受影响。 推测Asp210在催化中发挥基本作用的残基。替换Asp228，活性完全丧失。突变了118个残基，只有替换Asp228，活性的完全丧失，证明了个残基的重要性。哺乳动物cAMP侬赖的蛋白激酶晶体结构的证据，与Brenner的推测一致。保守残基的研究对理解关键氨基酸残基与蛋白活性关系具有重要的意义Asp210Asp228p126目前二十七页\总数三十页\编于十七点2、非保守残基的突变在蛋白质家族中，非保守的残基与家族成员（包括种属间的变种）的特异性有关，如：病毒的毒力。用定点突变方式进行替换——获得很多生物学活性的信息， 也可以获得具有新特异性的突变体蛋白质。举例：脊髓灰质炎病毒（2种型）：非毒型（I）和毒型（II）Ⅱ型诱发小鼠脊髓灰质炎，I型对小鼠无毒性。Ⅱ型毒力丧失的突变体证明：90-105残基负责Ⅱ型病毒对小鼠的毒力若将Ⅱ型的95-104残基环区域转移到无毒力的I型毒株中，杂合I型毒株表现出对小鼠的毒力，表明：脊髓灰质炎病毒识