基因工程的原理和技术

第二节基因工程的原理和技术基因工程的原理：基因重组基因工程的目标：让人们感兴趣的基因在宿主细胞中稳定和高效表达。基因工程的基本操作步骤：1）获得目的基因；2）形成重组DNA分子；3）将重组DNA分子导入受体细胞；4）筛选含有目的基因的受体细胞；5）目的基因的表达。步骤1：获得目的基因目的基因：是人们所需要转移或改造的基因如人的胰岛素基因、干扰素基因、白细胞介素基因、植物的抗病基因、抗虫基因、抗除草剂基因、种子贮藏蛋白的基因等。获得目的基因的方法：已知序列未知序列化学方法合成利用PCR技术扩增从基因文库获得1）人工合成已知其序列已知其mRNA的序列已知其翻译产物的氨基酸序列2）聚合酶链式反应即PCR技术氢键断裂，形成单链DNA。引物与DNA模板结合，形成局部双链。在酶的作用下，不断延伸，合成双链DNA。多次循环，获得大量双链DNA分子。PCR技术扩增基因文库：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系(克隆)，在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于某种生物的线粒体DNA或叶绿体DNA的基因文库。

基因库是指某一生物群体中的全部基因。基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。3）从基因文库中获取目的基因：基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.步骤2、重组DNA分子的形成：质粒DNA分子同种限制酶一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）GAATTCCGTAGAATTCGGATTCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTCTTAAGGCATCTTAAGCCTAACTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG思考：目的基因、运载体质粒经DNA连接酶处理，可能有几种产物？1、目的基因与目的基因结合；2、质粒与质粒结合；3、目的基因与质粒结合。(08海南)图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有

三种。目的基因—载体连接物载体--载体连接物目的基因--目的基因连接物

（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时

。载体--载体连接物；目的基因--载体连接、载体--载体连接物

EcoRI和BamHI（1）常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞等。步骤3、将目的基因导入受体细胞

（2）导入方法：（3）导入过程：受体细胞：细菌CaCL2细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制将目的基因导入受体细胞将受体细胞进行扩增借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术（最多、最有效）3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。①直接播导入法凳：电击赌、显微闯注射、坦直接吸蝇收、基淋因枪等场方法。（1）电悬击法：借绘助电击仪洞高压脉冲置把目的基夺因打入宿涂主细胞。（2）显聚微注射法框：利用微匪量注射器多在显微镜针下直接把纺目的基因羡注入宿主咬细胞。（3）吨直接吸叮收法：滴把目的昏基因和极宿主细税胞混在镰一起，棋让其吸蔽收。（4）顽基因枪卷法：在护金属微辩粒上涂捉一层目竹的基因究，然后伯发射到编宿主细开胞中。②间接文导入法脆：常用拣的载体群是质粒蓝、λ噬讨菌体。（1）质帖粒是细菌趋染色体D卧NA以外果的环状双衰链DNA避分子，它役能自我复兰制，也可傻整合到细睡胞染色体专DNA中卖与其一起帜表达。质威粒通常还贝含有标记丽基因，这惭可以从细涂胞的表型格特征来识获别。（2）λ种噬菌体是绩一种细菌循病毒，其掩环状双链曾DNA可央以作为目恨的基因的沾载体。采用基污因工程休的方法演培育抗吹虫棉，兽下列导辫入目的道基因的滨做法正梁确的是泡：(貌)①将毒素浙蛋白注射奇到棉受精丧卵中②将编响码毒素捎蛋白的突DNA果序列，下注射到瓣棉受精武卵中③将编拘码毒素批蛋白的悟DNA休序列，聋与质粒喘重组，余导入细滋菌，用股该细菌析感染棉壶的体细昆胞，再奸进行组顺织培养④将编码指毒素蛋白喷的DNA阀序列，与芝细菌质粒版重组，注从射到棉的调子房并进君入受精卵A.①②民B胞.②③赵C波.③④圈D.粱④①Ｃ步骤4冈、筛选闭含有目畏的基因系的受体储细胞抗四环素基因重组DNA四环素生长被抑制正常生活四环素步骤5仍、目的但基因的敬表达1、特定卖性状的产幼生与否；2、是短否产生翁特定的特产物。2．利毫用外源累基因在劫受体细荐胞中表街达，可帜生产人柔类所需枕要的产含品。下酿列各项炸中能说斑明目的腐基因完强成了在蜂受体细唐胞中表控达的是壤（侮）A．棉映花二倍岛体细胞勾中检测节到细菌相的抗虫遵基因B．大肠屋杆菌中检驰测到人胰英岛素基因借及其mR授NAC．山羊意乳腺细胞勿中检测到厌人生长激神素DNA虑序列D．酵母诉菌细胞中牺提取到人房诚干扰素蛋应白D思考：干扰素是召一种抗病胃毒药物，针其化学本质是蛋白里质，假如驻现在要用虑大肠杆菌来生产抗给病毒干扰项素，如何哨操作？载体质岛粒外源DN滑A片段外源DN驳A插入剪切引入宿冶主细胞选出含塔有重组张DNA香的细胞拜扩增A从人的淋淹巴细胞中城提取干扰但素基因，倘转移到大职肠杆菌质责粒中，再兰导入到其拾体内。(画图讲抵解)1用基欠因工程技怜术可使大抄肠杆菌合们成人的蛋屿白质。下婶列叙述不签正确的是A．常用肃相同的限称制性内切找酶处理的尿基因和质粒B．DN唐A连接酶渗和RN团A聚合酶犁是构建重场组质粒必礼需的工具轨酶C．可敌用含抗胖生素的姑培养基策检测大慨肠杆菌沫中是否遵导入了著重组质僵粒D．导勒入大肠制杆菌的平目的基开因不一嗽定能成功表达B巩固练捕习练习2．有埋关基因捷工程的旺叙述正傍确的是孔(望)A.限吹制性内竖切酶只魂在获得脖目的基被因时才岛用零B.重究组质粒赞的形成鞭在细胞肉内完成款C腔.质粒允都可以游作为载惜体鸭D.蛋哥白质的迎结构可暴为合成未目的基严因提供安资料D1.有简关基因盛工程的怖叙述中鼻，错误箱的是洒（手）A、DN造A连接酶逃将黏性末穷端的碱基脸对连接起飞来B、限制绸性核酸内暂切酶用于源目的基因蔽的获得C、目梅的基因法须由载细体导入狭受体细翁胞D、人工屋合成目的赔基因不用欲限制性内治切酶A6、将质ada域（腺苷点酸脱氨冶酶基因松）通过纸质粒p默ET2尾8b导惑入大肠毛杆菌并爬成功表鼓达腺苷敲酸脱氨疾酶。下净列叙述允错误的疗是A.每择个大肠杆虏菌细胞至堪少含一个养重组质粒B.每随个重组质嫁粒至少含颗一个限制填性核酸内本切酶识别巡寿位点C.肉每个限三制性核做酸内切糠酶识别胳位点至般少插入刚一个a寇daD.每枝个人的a迅da至少戒表达一个贺腺苷酸脱冰氨酶分子C如下图冷是将人刚的生长途激素基赔因导入彩细菌B透细胞内侮制造“畏工程菌打”示意活图（娘）注：GeneI和GeneⅡ表示两种标记基因表示限制酶仅有的识别序列放大GGATCCCCTAGGGATCCTAG目的基因GGATCCCCTAGGGeneIGeneIIGATCCTAG谢谢9、静夜四茅无邻，荒态居旧业贫羞。。4月-2需34月-者23Frid尘ay,偶Apri催l28怜,20滚2310、雨中卡黄叶树稼，灯下光白头人犬。。08:3降9:3808:纠39:闸3808:3患94/28粪/202搅38:位39:3乳8AM11、以我匆独沈久轰，愧君点相见频崭。。4月-毁2308:掉39:支3808:3槽9Apr令-2328-A胡pr-2滨312、故人江手海别，几难度隔山川沿。。08:议39:管3808:棍39:渠3808:剂39Frid跌ay,类Apri迁l28饺,20丽2313、乍见翻巷疑梦，相聋悲各问年殿。。4月-辆234月-2阀308:3罩9:3908:义39:恐39Apr渡il罩28,岛20烧2314、他乡薄生白发路，旧国深见青山概。。28四誓月20流238:39效:39漆上午08:克39:外394月-2厅315、比不了烘得就不比烛，得不到代的就不要环。。。四月敌238:3锡9上键午4月-2哪308:绿39Apri榨l28樱,20闪2316、行动线出成果受，工作凑出财富君。。202骗3/4执/28勉8:蔬39:议3908:3殃9:3928A彩pril越202增317、做前，筋能够环视祖四周；做迫时，你只俗能或者最清好沿着以颜脚为起点赚的射线向皆前。。8:3能9:3兴9上进午8:39催上午08:再39:五394月-袜239、没有帜失败，喊只有暂棋时停止棚成功！遇。4月-2篮34月-贪23Frid羊ay,青Apri巡寿l28性,20榴2310、很多事该情努力了贼未必有结氏果，但是原不努力却和什么改变碗也没有。医。08:3忌9:3908:留39:防3908:3齐94/28探/202汤38:信39:3袄9AM11、成功就连是日复一仍日那一点让点小小努扩力的积累鱼。。4月-量2308:3桐9:3908:3屈9Apr-隐2328-贷Apr寇-2312、世间成丘事，不求召其绝对圆序满，留一贿份不足，洋可得无限环完美。。08:3耗9:3908:3岁9:3908:峡39Frid崭ay,谅Apri扒l28付,20骡2313、不知场香积寺晚，数里评入云峰议。。4月-2胞34月-誉2308:3领9:3908:3仔9:39Apri辨l28顷,20规2314、意志坚你强的人能瘦把世界放幅在手中像怀泥块一样泛任意揉捏秘。28鸭四月棕202逼38:39喂:39贝上午08:泼39:物394月-2屡315、楚塞粗三湘接布，荆门除九派通糊。。。四月猫238:3劝9上箱午4月-寺2308:3灾9Apr裁il芝28,填20宜2316、少年票十五二坦十时，巩步行夺踏得胡马姿骑。。2023园/4/2柳88:畅39:3遵908:3伍9:3928A葛pril乖202吼317、空山材新雨后包，天气逢晚来秋责。。8:39允:39歼上午8:39占上午08:抱39:稀394月-2汪39、杨柳狡散和风埋，青山炭澹吾虑齐。。4月-2俗34月-垂23Fri原day缓,A盈pri袋l2矩8,叶202肿310、阅读悲一切好号书如同沫和过去悲最杰出仙的人谈答话。08:补39:愚4008:尊39:兴4008:呜394/28伏/202帜38:览39:4浓0AM11、越是乳没有本略领的就沟越加自蹈命不凡漠。4月-也2308:嘉39:担4008:潮39Apr-丑2328-A兄pr-2险312、越是无践能的人，层越喜欢挑蜘剔别人的羡错儿。08:玩39:浸4008:3培9:4008:3亿9Frid我ay,蜓Apri步