高中生物教学中关于PCR引物的难点问题创设与解决

高中生物教学中关于PCR引物的难点问题创设与解决摘要：高中生物学基因工程的教学中PCR引物是在必修二DNA复制学习时没有学习到的内容，学生感觉难以理解，比如引物是什么，为什么需要引物，合适的引物怎么设计，怎么和基因工程有机的结合起来。教师可以结合学生已经掌握的知识在课堂中创设问题，解决这些难点问题。现行普通高中生物学教材中，选择性必修3.生物技术与工程的第三章基因工程中目的基因的额筛选与获取涉及到利用PCR获取和扩增目的基因，PCR的原理和过程是学生应用这项技术解决情境问题必须掌握的。重要是重要，但在学生学习的过程中，由于其储备知识的不足，其实有很多关键问题是很难理解的。如，PCR为什么需要引物，为什么引物中还需要连接限制酶的识别序列等。初初遇到这些问题，学生也许并不知道此为何物，这时，需要我们教师通过精心设计的问题，引导学生利用自己已经掌握的有限的知识一步步认识到新的知识，并且能够利用新的知识去解决更为复杂的能力。科学素养，讲的就是学生通过学习这一学科最后能够形成的解决问题的能力。PCR技术只是一个知识点，我们要通过学生学习这一技术的过程，尽可能的让学生收获除知识以外的东西。一、高中生物学教学课堂问题创设与解决原则

课堂作为学生学习的主要阵地，要求精心的设计以帮助学生达到高效学习的目的。笔者所在的中学提倡以问题为主要载体引导学生自主思考、自主领悟知识，提问的原则有以下：（一）借助学生的既有经验，创造情境提问既有经验包括学生已经学过的知识，已经掌握的生活技能，已经有的人生态度，教师教学设计时创造一个具体的情境，从其中找出一些角度是以前学生不曾考虑过的，从这些角度提出问题，学生会觉得我学了这么久，居然从来不曾考虑过这个问题，顿时就会有一种征服解决这个问题的欲望，自然就会积极思考。比如在学生掌握PCR能够特异性的扩增出目的基因后，我们可以创设构建抗虫棉基因表达载体的具体情境，学生已经掌握用PCR扩增出目的基因，第3次循环后会得到两条链等长的目的基因DNA片段[1]，也已经构建基因的表达载体通常用限制酶切割载体和目的基因，此时提出PCR得到的目的基因是平末端，如何使其能够插入只有EcoRⅠ识别序列的载体质粒中去？学生往往认为只要有了目的基因，有了载体就一定能够连接成表达载体，并未从能不能连、怎么确保它一定能连的角度思考问题，这个问题一提出能引起学生的好奇心，开始思考怎么解决这个问题。(二）设置阶梯问题，帮助学生突破重难点一开始就丢给学生一个他根本解决不了的问题或者思维上要进行数轮转换才能解决的问题，学生纵然有征服欲也没有征服的能力。教师在进行教学设计的时候可以对于重难点设置一系列连环的问题，引导学生去一步步的向问题的制高点走去，每一个小问题都是“挑一跳摘苹果”的难度，学生会逐渐成长，慢慢的从只能喝流食到能吃点豆腐白菜到最后能啃硬骨头。比如上文中提到的难点问题，如何能让PCR得到的平末端目的基因，连接到只有EcoRⅠ识别序列的载体质粒中去，如果一开始就提出这个一个大的问题，学生需要转好几个弯才能想出办法，大部分学生暂时还做不到。教师可以循序渐进的提问，首先，摆出质粒的图片，问学生这个质粒作为载体该有什么酶切，产生的是什么末端？其次，摆出平末端的目的基因，问此时能够将目的基因直接连到该质粒中去，为什么?然后，如何使目的基因的末端也有相应的粘性末端？学生可能给出挺多中方案，教师要引导学生表述、甄别究竟哪种方案最好，最终解决问题。具体的解决办法见后文。二、PCR技术中几个需要重点突破的点及提问解决策略PCR技术要求学生掌握PCR的原理，反应体系，过程。原理是DNA的半保留复制，过程中的三个步骤大致也和DNA复制一致，可以DNA复制的过程来引导对比掌握。反应体系如下:10倍浓缩的扩增缓冲液5uL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1uL20umol/L的引物Ⅰ2.5uL20umol/L的引物Ⅱ2.5uLH2O28~33uL1~5U/uL的TaqDNA聚合酶1~2U模板DNA5~10uL总体积50uL其中出了扩增缓冲液和引物，其他都可以与DNA复制的过程联系起来理解。扩增缓冲液是扩增反应进行的液体环境，学生容易理解，引物则是第一次接触到，是教学过程中必须解决的问题。人教版教材77页对于引物的介绍为“引物是一小段能与DNA母联的一段剪辑序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。”通过教学，确实需要学生形成上述概念，但如何形成这一概念，需要教师一步步的设置问题，突破理解中的难点。难点一：为什么需要引物

引物的相关知识在必修二的教材中并没有提及，这里视乎上课的老师之前有没有给学生补充过相关知识。本文中假设学生并不知道DNA复制过程中需要引物，突破引物知识点的方案如下：1.给出图1，回顾DNA复制的有关知识,问DNA聚合酶的作用。仔细观察，可以得出DNA聚合酶的功能是按照子链5’→3’的方向在3’催化连接脱氧核苷酸以延伸子链。DNA聚合酶的功能是在基因工程的基本工具那一节就和DNA连接酶做过对比的，所以此处简单提问回忆即可。给出图2，提问回答，得出DNA的子链合成需要与模板链互补的一段短链核酸片段做引物的概念问1：图2与图1有什么差别?

图2中每一段正在合成的DNA子链的前面都有一段虚线片段。问2：你猜测虚线片段是做什么用的？作为起点延伸子链的。问3：虚线所代表的就是引物，其化学本质是什么？与模板连3’端互补的一小段短单链核酸片段。问4：是DNA还是RNA？

学生可以莫衷一是，有回答DNA的，也有回答RNA的，教师此时给与全面肯定，其实都可以，都是核酸片段。另外补充：DNA分子体内复制所需引物主要是一小段RNA。问5：如果引物是RNA，合成的子链就不是纯DNA链，后期你觉得还需要什么处理？后期还需要把引物切除，并对切除部位进行修复。学生只需要了解这么多，至于备课老师，提供以下参考内容：RNA引物只是启动DNA复制，但在复制结束后，引物必须切除，否则混杂RNA片段的DNA分子影响其结构的稳定，也影响遗传信息的传递与表达。在原核细胞内，切除RNA引物的酶是DNA聚合酶I或核糖核酸酶H，其中DNA聚合酶I既有5′→3′方向延伸脱氧核苷酸链功能，还具有5′→3’和3′→5’外切核酸酶的活性，所以DNA聚合酶I凭借5’-外切酶的活性切除总是位于5′端的RNA引物。核糖核酸酶H是一种特殊的内切核酸酶，专门水解与DNA杂交的RNA，包括RNA引物，如T4噬菌体DNA复制中引物的切除，也可通过宿主细胞的DNA聚合酶I切除。而真核细胞的任何一种DNA聚合酶均没有5’-外切酶活性，因此负责切除RNA引物的酶主要是核糖核酸酶H。切除后的DNA片段由DNA连接酶连接在一起形成连续的DNA链。如果是体外DNA复制，由于引物是DNA片段，所以不需要切除引物。[2]问6：体外进行DNA复制的时候，引物用DNA片段还是RNA片段？这里自然选择DNA片段。问7：根据以上讨论，请对DNA聚合酶的功能加以补充。DNA聚合酶的功能是按照子链5’→3’的方向在3’催化连接脱氧核苷酸以延伸子链补充为DNA聚合酶的功能是按照子链5’→3’的方向在引物的3’催化连接脱氧核苷酸以延伸子链。问8：为什么PCR需要引物？因为酶的功能专一，PCR用的耐高温的DNA聚合酶只能在引物的3’端连接脱氧核苷酸以延伸子链。至此，学生已经对DNA复制以及PCR过程中需要引物有了概念，并且明白了这是DNA聚合酶功能特点所需的。当然，作为教师，我们可能需要掌握更多，比如有的DNA聚合酶是不需要引物的。

难点二：引物的设计PCR的目的是扩增出某段特异的目的DNA片段，为了确保能够对目的DNA片段进行准确高效的扩增，引物的设计显得非常重要。围绕PCR过程中引物的设计，设计了以下解决方案：给出图3，请学生选择能把目的基因（虚线部分）扩增出来的引物。学生可能给出很多的选择，教师设计问题引导学生最终认识到选择的引物应该是2&3。大致涉及的问题如下，不过可以根据具体上课时学生的回答情况予以取舍。

问1：如果选择引物1，则子链会朝途中哪一边延伸，为什么?

结合DNA聚合酶作用的方向性，学生可以很容易的回到出这个问题。问2：为什么不选择1&4?

因为引物1和引物4，子链会向模板DNA的两端延伸，不能扩增出目的基因（虚线部分）片段，展示图4。

随后可以组织学生参照教材PCR的过程图对PCR的过程进行画图理解[3]，重点理解每一轮反应的3个步骤和第三轮循环才出现两条链等长的扩增片段。此部分不是本论文探讨的主要内容，此处略。在学生掌握PCR的过程后，我们可以继续提问，以加探讨PCR引物设计除了方向性以外的要注意的问题。问3：设计引物时，需要知道目的基因的全部序列信息吗？如果不需要，那需要知道的序列信息是？

不需要知道目的基因的全部序列信息，只需要知道目的基因两侧的序列信息即可。问4：给出图5，提问3种引物方案中最佳引物是哪种？

学生可以辨析出最佳的是方案二，刚好能够把目的基因（虚线片段）扩增出来，不长也不短。教师可以加以说明，其实三种方案可能都可行，主要看引物的设计方便程度。问5：如方案二中的引物序列是CTAGCCCCCTAGAGGGGGA其中的CCCCC与GGGGG容易内部自身配对，那么它还是最佳方案吗？为什么？这样的引物在复性步骤中不容易和模板链配对，不是最佳方案了。问6;引物设计时除了方向问题，我们还应注意一些什么问题？

通过之前的问题，学生可以总结出的有引物自身不能含有互补序列，稍加延伸可以想到两个引物也不能互补配对。至于其他设计引物时应该注意的问题，高中阶段可以不掌握。给出图6，通过问题引导学生对引物设计与其方向性有进一步认识。

问7：按照图中的引物来PCR，最终扩增出的是图中的哪个片段？

扩增出的是图中未知序列（白色）的片段。难点三：引物与限制酶识别序列的连接

普通的引物可以实现将目的DNA片段扩增出来的目的，但是扩增出来的片段是没有黏性末端的，这并不方便于将来构建表达载体。学生需要能够利用所学知识解决这一问题，教学中可以设计以下问题，一步步的引导学生得出设计引物时可能需要考虑将来用的限制酶的识别序列的结论。问1：PCR扩增出来的目的基因片段具有什么末端？

平末端问2：扩增出的片段中靠近末端的序列是什么序列？

在两端分别是两个引物的序列问3：提供给你的载体质粒上只有限制酶EcoRⅠ的识别序列，如何把目的基因插入到该质粒上去？用EcoRⅠ分别切割质粒和目的基因，然后用DNA连接酶将二者连接起来。问4:目的基因能用EcoRⅠ切割出粘性末端吗？

能不能要看扩增出的片段是否有EcoRⅠ的识别序列。问5：如果扩增出的片段有EcoRⅠ的识别序列，要求它位于片段的哪个部位？位于片段的两端问6：如果扩增出的片段没有EcoRⅠ的识别序列，你如何解决这个问题？

学生可能回答给扩增出的片段两端接上EcoRⅠ的识别序列.问7：如果在扩增完成后给每一个扩增出的片段连接上EcoRⅠ的识别序列，会存在连接成功率的问题，有没有办法使扩增出的每一个片段都保证有EcoRⅠ的识别序列呢？把EcoRⅠ的识别序列加在引物上可以保证，即设计的引物的结构为“5’EcoRⅠ的识别序列+与模板链配对的序列3’”。得出这个结论后可以用一个相关练习题强化，笔者在教学中实践操作了，学生理解掌握程度很不错。本文重点以有关PCR所需引物的难点为例通过问题设计，引导学生解决问题，形成相应的基本观念、概念。通过有素的训练，期待学生能够将新情境下遇到的难点问题，利用自己已经掌握的知识、能力去加以拆分、推理，最后解决。苏霍姆林斯基说：人的心灵深处有一种根深蒂固的需要，就是希望自己是一个发现者、研究者、探究者。[1]发现、研究、探究问题驱动课堂成为高效的课堂，教师可以好好利用。作者信息[1]唐一枝.（1988—），女，大学本科学历，中小学一级教师，E-mai396206817@湖南省桃源县第一中学生物学教师,，属湖南省教育科学研究工作者协会课题《以生命观念为核心的高中生物学教学课堂问题创设与解决策略研究》（XJKX20A145）小组主持人。参考文献[1]高成.一问题解决为向导，构建高效生物课堂——以“DNA的PCR扩增”教学为例[J].教学月刊.