第二十六章基因工程药物演示文稿

第二十六章基因工程药物演示文稿目前一页\总数三十一页\编于七点优选第二十六章基因工程药物目前二页\总数三十一页\编于七点基因工程药物概论基因工程药物含义基因工程药物是指采用基因工程技术研制的，能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以用传统方法制取的特殊药物。目前三页\总数三十一页\编于七点一、基因工程药物种类蛋白细胞因子药物蛋白类激素溶血栓药物治疗用酶可溶性受体和黏附分子其它核酸DNA药物反义RNA药物RNAi药物核酶目前四页\总数三十一页\编于七点重组蛋白质类药物细胞因子药物：干扰素、集落因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、凝血因子蛋白质类激素药物：生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、促卵泡素、甲状旁腺素、降钙素、胰高血糖素、促黄体生成素、甲状腺刺激素和心钠素等。溶血栓药物：组织型纤溶酶激活剂、尿激酶型纤溶原激活物、蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、链激酶和葡激酶等。治疗用酶：超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。可溶性受体和黏附分子：可溶性补体受体Ⅰ型其他：血红蛋白、白蛋白等。目前五页\总数三十一页\编于七点核酸类药物核酸类药物主要是在核酸水平(DNA和RNA)上发挥作用，它通过纠正突变的基因并使之重新获得适当的功能来治疗或预防疾病。特点是：能将基因表达的产物的作用局限于病变组织周围，从而使治疗更具针对性；只要转化细胞不被清除，转化的式因不被抑制，基因表达的产物就可以持续发挥作用。目前六页\总数三十一页\编于七点基因工程药物的特点从根本上解决了某些药物的生物原料适应证不断延伸技术含量高加速疑难病症新药物的开发目前七页\总数三十一页\编于七点二、研制基因工程药物的关键技术确定研制基因工程药物的技术路线基本技术路线1：获得具有预防和治疗作用的蛋白质的基因组入表达载体受体细胞高效表达动物试验临床试验申报新药证书

基本技术路线2：基因组未知功能的人类基因全长cDNA群组入表达载体受体细胞瞬间表达功能初筛功能验证重组蛋白表达体内外药效分析临床前研究临床验证申报新药证书优点：目的明确。缺点：发现新药的机率低，在人体内表达量较高的蛋白质才有较大可能被开发。建立在庞大人类基因资源基础上的，具有巨大的开发潜力，缩短新药开发的时间，可大规模增加新药的数量。目前八页\总数三十一页\编于七点

目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线目前九页\总数三十一页\编于七点基因工程的操作流程1、分：分离目的基因2、切：对目的基因和载体适当切割3、接：目的基因与载体连接4、转：重组DNA转入受体细胞5、筛：筛选出含有重组体的受体细胞6、表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物目前十页\总数三十一页\编于七点基因工程制药的基本过程获得目的基因

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构建重组质粒

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组建基因工程细胞

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工程菌培养

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产物分离纯化目前十一页\总数三十一页\编于七点目前十二页\总数三十一页\编于七点13三、基因工程制药实例目前十三页\总数三十一页\编于七点人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor，GMCSF）是一个具有多项潜能的造血生长因子，它不仅能够促进造血前体细胞的增殖、分化和成熟，而且对其它的细胞，如抗原递呈细胞、成纤维细胞、角质细胞、皮肤粘膜细胞等，均有着不同程度的刺激作用。GMCSF对某些疾病，如肿瘤患者放疗、化疗以后的白细胞减少症、再生障碍性贫血和骨髓移植的治疗有重要作用，以及在抗病素、抗真菌感染等的治疗中也有良好的疗效。目前十四页\总数三十一页\编于七点1985年Sieff等发表了第一篇有关重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的文章后，这些年来有关rhGMCSF研究报道的文献每年均在千篇左右。GMCSF是糖蛋白，相对分子质量为22000，基因定位在第5条染色体长臂上，基因约2.5kb，含有4个外显子和3个内含子。其mRNA包括编码成熟蛋白质的127个氨基酸残基和信号肽的17个氨基酸残基的密码子。目前十五页\总数三十一页\编于七点重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子产品目前十六页\总数三十一页\编于七点1.人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的制备利用表达分泌型GMCSF工程菌W3100/pGMCSF可以表达具有天然结构和生物活性的GMCSF，表达量高，易于纯化，无需复性，纯化的GMCSF比活高于包含体型，但其发酵表达技术较难掌握。目前十七页\总数三十一页\编于七点分泌型GMCSF工菌型W3100/pGMCSF发酵工艺发酵甘油保存菌划平皿，挑取单菌落，接种于LB种子培养基中，18h，再扩大培养12h，接种于30L发酵罐，30℃培养，过程中流加50%的葡萄糖、酵母浸出液及酷素水解物。培养20h左右时开始表达，28h表达是高峰，之后细菌开始死亡，杂蛋白增加。培养过程中，尤其是对数期，用葡萄糖的加量来控制细菌生长速度，以免溶氧量下降过快。发酵产物为分泌型GMCSF，占菌体总蛋白的25%以上。目前十八页\总数三十一页\编于七点发酵产物收集、纯化离心离子交换层析或亲和层析纯化超滤浓缩，分子筛除菌过滤、分装、冻干目前十九页\总数三十一页\编于七点近年应用较多的还有融合蛋白表达GMCSF的方法。采用ＰＣＲ方法改建人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子的ｃＤＮＡ，３′换用ＴＡＡ终止密码，将其克隆入多种不同表达融合蛋白的载体中，并在ｃＤＮＡ与上游细菌蛋白基因之间嵌入凝血酶接头，导入适当宿主后均获得高效表达，表达融合蛋白经凝血酶消化后释放出Ｎ－末端与天然成熟蛋白一级结构（糖基化除外）完全相同的ｒｈＧＭＣＳＦ，经层析纯化可得到适宜人体应用的活性蛋白。目前二十页\总数三十一页\编于七点2.质量控制标准和要求半成品检定

主要包括下列项目：蛋白质含量测定，活性测定，比活性测定，相对分子质量测定，纯度测定，核酸含量测定，鼠IgG含量测定，等电点测定，无菌试验，热原质等。成品检定

主要包括下列项目：外观检查，活性测定，水分测定，无菌试验，安全毒性试验，热原质试验，肽图测定等。目前二十一页\总数三十一页\编于七点二、干扰素干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素再分为α1b、α2a、α2b等亚型，其区别表现为个别氨基酸的差异。早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要。目前二十二页\总数三十一页\编于七点1、基因工程菌的组建人染色体上的干扰素基因只有1.5%，拷贝量极少，所以不能直接从人体的染色体上分离干扰素基因。目前二十三页\总数三十一页\编于七点组建干扰素工程菌的流程诱生的白细胞提取全RNA通过寡dT-纤维素柱获得mRNA5%～23%蔗糖密度梯度离心提取12S的mRNA自mRNA反转录成cDNA双链cDNA用末端DNA转移酶接上dT或dG尾pBR322质粒pBR322质粒DNA的PstⅠ酶切割加上dA或dC

退火获得杂交质粒转化大肠杆菌K12扩增杂交质粒筛选抗四环素但对氨苄青霉素敏感的细菌克隆

用已知干扰素的DNA片段作为探针挑选富有干扰素cDNA的克隆

将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达

目前二十四页\总数三十一页\编于七点2.基因工程干扰素的制备制备基因工程α-干扰素工艺流程如下：启开种子制备种子液发酵培养粗提半成品检定半成品制备精提

分装冻干成品检定成品包装目前二十五页\总数三十一页\编于七点2、基因工程菌的发酵生产人干扰素a-2b的基因工程菌为SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a。

质粒使用PL启动子，含有四环素抗性基因。

种子培养液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl

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基因工程菌接种到4个1000ml三角烧瓶之中，每个烧瓶内装有250ml种子培养基，30℃摇床培养10小时，作为发酵罐的种子↓

用15L发酵罐进行发酵，装发酵培养基10L

发酵培养基组成如下（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.05%NaCl、0.01%NH4Cl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄糖、50mg/ml四环素、少量防泡沫剂，PH=6.8。）↓

搅拌转速500r/min、通气量为1：1v/v*min、溶氧量为50%

30℃发酵8小时（细菌增殖阶段）

42℃诱导2-3小时（产物生产阶段）↓

鉴控手段：每隔不同时间，取2毫升发酵液，10000r/min离心除去上清液，称量菌体湿重。目前二十六页\总数三十一页\编于七点3、干扰素的制备发酵物质4000r/min离心30min，除去上清液，得湿菌，从其中取100g。悬浮于20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）500ml之中，冰浴条件下进行超声破碎。

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4000r/min离心30min，除去上清液。沉淀部分用100ml提取液在室温条件下，进行搅拌抽提2小时，提取液组成配方[8mol/L尿素、20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）、0.5mmol/L二巯基苏糖醇]。

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提取液15000r/min离心30min，下层不溶弃去。取上清液，用20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）稀释至尿素浓度0.5mol/L

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加入0.1mmol/L二巯基苏糖醇，4℃搅拌15小时。15000r/min离心30min，除去不溶物。上清液用截流量=10000相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩

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浓缩液采用SephadexG50层析柱分离，层析柱2cm*100cm、先用20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）平衡固定相，上柱之后，用同一缓冲液洗脱分离

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收集人干扰素a-2b部分，用SDS检查。再经DE-52柱进行纯化

层析柱2cm*50cm、上柱之后，分别采用含有0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L的NaCl的20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）洗涤。

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收集含有收集人干扰素a-2b部分。分装→冻干→成品鉴定→成品包装。

[得率要求：全过程蛋白质回收率为20-25%，产品不含杂蛋白质、DNA、热原质检测合格。]目前二十七页\总数三十一页\编于七点4、质量控制标准和具体要求（1）半成品检定（2）成品检定目前二十八页\总数三十一页\编于七点（1）半成品检定--13项指标1、干扰素效价测定采用细胞病变抑制法，用Wish细胞、VSV病毒作为基本检测系统，对照国家标准、或者国标参考品。2、蛋白质含量测定用福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白质作为对照3、比活性测定干扰素效价国际单位÷蛋白质含量的毫克数4、纯度测定（1）银染显色法测定应为单一显色区带，（2）扫描仪测定纯度应在95%以上，（3）SDS电泳测定允许少量聚合体存在，但不超过10%，（4）高效液相色谱测定应呈一个吸收峰状态，主峰应占峰总面积的95%，（5）GPC柱纯度测定也应呈一个吸收峰状态，主峰应占峰总面积的95%。目前二十九页\总数三十一页\编于七点5、相对分子量测定用还原型SDS法，加样不低于5ug，用已知分子质量的蛋白质标准化系列作对照，迁移率为横坐标、相对分子质量的对数作为纵坐标，计算相对分子质量，其误差不得高于10%。6、残余外源性DNA含量测定用放射性核素或生物素探针法测定，每一剂量中的残余外源性DNA应低于100pg。7、残余抗生素活性测定凡是菌种传代中使用过抗生素的基因工程产物，必须进行残余抗生素活性测定，半成品中不得检出残