疾病相关遗传位点的识别

2014级“生命科学综合”核心课程疾病相关遗传位点的识别

DissectionTheGeneticLociOfDiseases邓国宏研究员第三军医大学西南医院全军传染病研究所目前一页\总数六十七页\编于三点11个让你与众不同的“标签”DNA指纹脸部步态耳朵眼睛声音气味心跳脑波微生物组目前二页\总数六十七页\编于三点Nowthisisnottheend.Itisnoteventhebeginningoftheend.Butitis,perhaps,theendofthebeginning

——WinstonChurchill目前三页\总数六十七页\编于三点遗传变异——大爆炸初始的量子涟漪目前四页\总数六十七页\编于三点疾病遗传学的范畴

Germlinevariation:inheritedordenovoCausalvariantsAssociatedorrelatedvariants(risk)

Somaticmutation:tumor,TCR/Igrepertoire

Epigeneticregulation目前五页\总数六十七页\编于三点一、如何识别疾病相关的遗传变异目前六页\总数六十七页\编于三点完全由遗传决定的疾病基本由遗传决定，但需要环境诱因遗传和环境因素都起作用完全由环境因素决定1234100%遗传度（率）0%染色体病、单基因病复杂疾病（多基因病）新生儿（‰）25岁（‰）整体人群（‰）染色体病61.83.8单基因病103.620多基因病～50～50～600三种类型遗传疾病的人群患病率目前七页\总数六十七页\编于三点疾病相关遗传变异识别的要素疾病表型的界定：定义、类型、机制样本类型及数量

家系病例和对照研究策略遗传标记及分型方法分析和解读功能解释目前八页\总数六十七页\编于三点一张肝功报告单引发的“不和谐”检验出错？肝炎后淤胆？肝硬化失代偿？抗病毒药物不良反应？治疗？Vs.不治疗？…目前九页\总数六十七页\编于三点高间接胆红素血症的表型新生儿核黄疸罕见病青少年或成年苯巴比妥治疗自限性表现常见病目前十页\总数六十七页\编于三点UGT1A1基因变异类型决定遗传性高间接胆红素血症的表型罕见常见目前十一页\总数六十七页\编于三点疾病遗传学研究策略取决于变异遗传效应强度和变异的频率ManolioTA,etal.Nature2009;461:747-753基于候选基因的遗传关联研究基于全基因组范围的遗传关联研究基于家系的连锁定位研究外显子组/全基因组直接测序目前十二页\总数六十七页\编于三点人类遗传变异

染色体变化（数目、转位）

重排，大片断插入/缺失多碱基变异

微卫星,重复序列多等位

HLA超过1100个等位

单碱基变异（SNV/SNP）双等位

颠换transversion

转换transition

单碱基插入/缺失（indel）

拷贝数变异（CNV）线粒体遗传变异目前十三页\总数六十七页\编于三点遗传标记的迅猛发展：从少到多，从稀到密目前十四页\总数六十七页\编于三点宇宙微波背景辐射疾病遗传学的研究思维：从现在推测过去，从存在推测起源目前十五页\总数六十七页\编于三点基于疾病家系的连锁分析目前十六页\总数六十七页\编于三点基于散在人群的遗传关联研究人类基因组的连锁不平衡结构影响疾病的位点显示关联信号目前十七页\总数六十七页\编于三点二、经典文献导读目前十八页\总数六十七页\编于三点RemeoS,KozlitinaJ,XingC,etal.GeneticvariationinPNPLA3conferssusceptibilitytononalcoholicfattyliverdisease.NatGenet2008;40(12):1461-1465非酒精性脂肪性肝病Molho-PessachV,RiosJJ,XingC,etal.Homozygositymappingidentifiesabileacidbiosyntheticdefectinanadultwithcirrhosisofunkownetiology.Hepatology;2012;55(4):1139-1145

胆酸合成缺陷性肝硬化目前十九页\总数六十七页\编于三点1.常见复杂疾病的GWAS研究范例常见复杂疾病高血压、糖尿病、痛风、神经精神系统疾病、肿瘤、感染…RemeoS,KozlitinaJ,XingC,etal.GeneticvariationinPNPLA3conferssusceptibilitytononalcoholicfattyliverdisease.NatGenet2008;40(12):1461-1465非酒精性脂肪性肝病目前二十页\总数六十七页\编于三点常见复杂疾病慢性病多基因病复杂性状多基因性状

定量性状定性性状基因-基因相互作用基因-环境相互作用年龄、性别修饰生活、行为方式饮食、营养目前二十一页\总数六十七页\编于三点过去：大海捞针、局部信息现在：一网打尽、整体认识科学思维：GPS全球卫星定位目前二十二页\总数六十七页\编于三点科学假说：人类基因组的连锁不平衡结构大样本人群全基因组范围捕获疾病的位点的关联信号目前二十三页\总数六十七页\编于三点MaterialsandMethodsUniversityofTexasSouthwesternMedicalCenter

发现队列：TheDallasHeartStudy，3551名研究对象（欧裔、非裔、西班牙裔）

临床资料：血压、BMI、饮酒量、空腹血糖、血生化指标专项检测：2240人还检测了肝脏甘油三酯含量（1H-MRS）

遗传标记及分型：全基因组范围12138个非同义SNPs,PerlegenSNP芯片分型

验证队列：AtherosclerosisRiskinCommunitiesStudy(ARIC,n=14821)

验证队列rs738409分型：MGB-TaqMan方法

关联基因PNPLA3的人群变异负载观察：PCR-毛细管测序目前二十四页\总数六十七页\编于三点PNPLA3变异影响肝细胞脂肪量和脂肪性肝炎rs738409CGI148MPNPLA3编码蛋白为481个氨基酸，属于patatin-like磷脂酶家族，具体功能不清楚Patatin是土豆的富含蛋白，表现出非特异脂酰基水解酶活性目前二十五页\总数六十七页\编于三点目前二十六页\总数六十七页\编于三点rs738409CG,I148MPNPLA3rs738409[G]等位与肝脏脂肪含量相关，与糖、脂代谢异常无关目前二十七页\总数六十七页\编于三点rs6006460GTS453I三个无效变异个体均在高脂肪含量组，表明PNPLA3失功能变异导致脂肪含量升高在非裔中找到另一个PNPLA3基因的获功能变异rs6006460(S453I)与肝脂肪量相关目前二十八页\总数六十七页\编于三点PNPLA3功能变异的频率可以解释不同人群脂肪肝发病率AfricanAmericans24%,EuropeanAmericans33%,Hispanics45%LossGain不同祖先人群肝脂肪量差异的72%可归因于I148M和S453I变异目前二十九页\总数六十七页\编于三点本研究的亮点创新性：肝细胞脂肪量GWAS、PNPLA3决定性位点重要性：发现决定肝细胞脂肪量的因素独立于血脂、BMI、糖尿病发现了新的脂肪肝机制和靶点（PNPLA3途径）两个独立的遗传变异，Gain和Loss

人群变异频率反映了人群发病率的高低与脂肪性肝损伤的关联艰巨性：大样本人群（n=3383）、独立样本验证（ARIC）氢谱核磁共振方法测定了肝细胞脂肪量（n=2240）目前三十页\总数六十七页\编于三点本研究的不足SNP标记覆盖度不高

12138nsSNPs分型，最终9229个参与分析漏掉了调控区SNPs、CNVs、潜在的新基因/miRNA区域关联区域的连锁不平衡结构没有分析未进行第二轮独立验证

ARIC人群为验证人群，仅验证了其他指标如BMI、血脂等

ARIC人群缺肝细胞脂肪量数据，阳性性状缺独立样本验证功能证据

未检测不同基因型PNPLA3的酶活性（组织或细胞水平）目前三十一页\总数六十七页\编于三点Diabetes2009;58(11):2616-23肝脂肪含量（德国）

JBiolChem2010;285(9):6706-15I148M变异阻碍甘油三酯水解（作者团队）

PNAS2010;107(17):7892-7

PNPLA3的SREBP-1c正反馈转录调节（作者团队）Hepatology2010;52(3):904-12成人NFLD肝组织损伤程度（麻省总医院）Hepatology2010;52(3):894-903儿童NAFLD肝组织损伤程度（NIH）Hepatology2010;52(4):1281-90肥胖儿童/青少年肝脂肪变性（耶鲁大学）PLoSGenet2011;7(3):e1001324肝脂肪变性（密歇根大学）PLoSGenet2011;7(4):e1001374血清可溶性ICAM-1水平（哈佛医学院）

JBiolChem2011;286(43):37085-93（作者团队）

蛋白功能研究证实PNPLA3特异水解甘油酯，I148M导致此水解活性受损Hepatology2012;55(3):781-9青少年NAFLD（耶鲁大学）HumGenet2012;131(7):1145-52NAFLD发生（马来西亚）

JClinInvest2012;122(11):4130-44I148M转基因鼠证实PNPLA3对肝细胞TG的重塑作用（作者团队）PLoSOne2012;7(11):e50256NAFLD发生（中国）PLoSOne2013;8(3):e58734PSC患者的生存预后（德国）后续研究目前三十二页\总数六十七页\编于三点脂肪肝的新机制、新靶点目前三十三页\总数六十七页\编于三点2.罕见单基因疾病遗传学研究范例罕见单基因疾病杜氏肌营养不良、地中海贫血、Wilson病、先天性免疫缺陷…Molho-PessachV,RiosJJ,XingC,etal.Homozygositymappingidentifiesabileacidbiosyntheticdefectinanadultwithcirrhosisofunkownetiology.Hepatology2012;55(4):1139-1145遗传代谢性疾病：胆酸合成障碍目前三十四页\总数六十七页\编于三点基于疾病家系的连锁分析目前三十五页\总数六十七页\编于三点纯合子作图一种特殊的连锁分析适用于近亲结婚引起的隐性遗传病较小的家系、较少的病患数实验量小，定位迅速Hypothesis致病基因区域一定是纯合子区域目前三十六页\总数六十七页\编于三点首发病例（proband）A24-year-oldArabwoman(III.14)，来自伊朗西南部Khuzestan

不明原因的肝硬化，伴有门脉高压、腹水、静脉曲张黄疸、皮下瘀斑、脾大、轻度的足部水肿肝功能指标：AST67,ALT50IU/L,ALP153IU/L,andanormalGGTlevel(14IU/L)，总胆红素1.8mg/dL(normal0.2-1.3mg/dL)，直接胆红素1.3mg/dL(normal0.0-0.3mg/dL),INR2.0(normalrange:0.8-1.2),白蛋白3g/dL(normalrange:3.4-5.4g/dL)腹部CT：结节性肝脏,胃食管静脉曲张,脾脏24cm肝活检：桥接样纤维化，肝小叶周围胆管异常实验室检查排除了Wilson’s病，血色病,a1抗胰蛋白酶缺陷以及病毒性、自身免疫性肝病否认饮酒史目前三十七页\总数六十七页\编于三点家族史调查Hersisterandafirstcousindiedofcirrhosis(ages19and6years)andanother32-year-oldfirstcousinhadaself-limitedliverdisorderinchildhoodthatresolvedatage9yearsThefamilyhistorysuggestedthattheaffectedfamilymemberswerehomozygousforamutantalleleinheritedidentical-by-descent目前三十八页\总数六十七页\编于三点全基因组纯合子作图：两个患者，一个健康堂妹全基因组范围240万个SNP分型Human-Omni2.5BeadChipmicroarray(Illumina)候选区域筛选标准：Regionsofhomozygosity>3MbareshownTheregionsthatwerepresentinbothaffectedfamilymembersthatwerenothomozygousinanunaffectedfamilymemberareshowninboxes总共5个符合条件的纯合子区域目前三十九页\总数六十七页\编于三点16号染色体一个6.3Mb纯合子区域(25,073063-31,378235)符合筛选条件此区域有一个可疑后续基因HSD3B7测序发现两个患者的HSD3B7基因外显子1都有2bp缺失变异(c.45_46delAG,p.T15Tfsx27)，而健康堂妹没有此变异对其他家系成员进行测序验证候选基因HSD3B7测序目前四十页\总数六十七页\编于三点负离子FAB-MS检测确认3β-HSD缺陷胆酸合成缺陷的生化学确认Thetripletsofionsatm/z453,

469,and485(sulfateconjugates)andm/z510,526,

and542(glyco-sulfateconjugates)arecharacteristicof

monohydroxy,dihydroxy,andtrihydroxybileacids,

respectively,withastructuralfeatureofa3b-hydroxy-D5

structure目前四十一页\总数六十七页\编于三点本研究的亮点先症者胆酸合成缺陷，但存活了20余岁没有治疗先症者堂姐（家族成员III.5）9岁时出现过严重的肝病表现，但其后23年一直没有症状。这是迄今报道的唯一的无临床表现的成年3β-HSD缺陷者，也是年纪最大的3β-HSD酶缺陷患者。患者也没有脂肪吸收障碍或软骨病的表现有报道的唯一1名成年3β-HSD酶缺陷者在出生后有新生儿淤胆和软骨病，26岁再次出现淤胆症状临床重要性：疑难诊断的范例，诊断出来即可特异性治疗，诊断清楚后预后良好目前四十二页\总数六十七页\编于三点本研究的局限不是新的疾病不是新的致病基因不是新的致病变异无法解释同样的纯合变异、同样的生化缺陷变异外显度和患者表型的差异后续需要做的研究建立人类3β-HSD缺陷遗传变异数据库功能变异的外显度因素（denovo变异的异位显性、补偿）产前诊断、慢性肝病鉴别诊断筛查目前四十三页\总数六十七页\编于三点三、疾病相关遗传位点识别的前沿与展望目前四十四页\总数六十七页\编于三点全基因组关联研究（GWAS）高通量平行测序（NGS）

针对常见复杂疾病（2006年）针对单基因病和低频变异（2008年）整体解析时代：标志性、引领性前沿技术目前四十五页\总数六十七页\编于三点Rarevariations,rarediseases(exomeresequencing)Commonvariations,commondiseases(GWAS)Intermediate?？Functionalrelationship?Penetrance?Interactions?目前四十六页\总数六十七页\编于三点SampleCase1Case2Control1Control2TotalnumberofSNPs78,44181,37181,77583,815Novel(notindbSNP135)2,6612,7782,9082,865Missense(novel)7,599(383)7,765(376)7,462(397)7,743(382)Nonsense(novel)66(6)67(11)54(9)64(9)Splicesite(novel)456(23)463(26)427(16)451(23)Totalnumberofindels2,4632,4482,4892,511Novel(notindbSNP135)2,1012,0962,1142,150Novelcdsindels224224235233Splicesite(novel)112(99)107(92)106(92)109(97)TotalnumberofVariants80,90483,81984,26486,326Novel(notindbSNP135)4,7624,8745,0225,015NS/SS/Indel(novel)8,527(736)8,690(729)8,354(750)8,662(744)我们关于一个不明原因肝硬化家系的外显子组序列分析建立足够数量和质量的疾病遗传资源库鉴定疾病特异性、人群特异性的致病变异目前四十七页\总数六十七页\编于三点鉴定散发病例的致病变异存在挑战：组合模式?变异负载?

Cell2011;145:1036-1048建立变异-表型数据库目前四十八页\总数六十七页\编于三点Nature2014;NEJM2014目前四十九页\总数六十七页\编于三点绘制常见复杂疾病的全基因组遗传关联图谱全基因组范围有多少个位点影响疾病的发生、发展每个位点贡献了多大的比例关键的功能变异集中在哪些通路（潜在干预靶点）目前五十页\总数六十七页\编于三点SNPsassociatedwithautoimmunedisordersthatfallwithinDHSs,24.4%localizeinrecognitionsequencesofTFsthatinteractwithIRF9Science2012;Science2014目前五十一页\总数六十七页\编于三点eSNPssharedbetweencelltypesmayleadtoopposingdirectionaleffectsongeneexpressioninacelltype–specificmannerNatGenet2012;Science2014目前五十二页\总数六十七页\编于三点AGenomicRoadMapforComplexHumanDiseaseScience2014;343:1087-1088目前五十三页\总数六十七页\编于三点AhumanCLP1mutationcausesbrainandmotorneurondegenerationMutationimpairskinaseactivity,nuclearlocalization,andTSENcomplexassemblyCell2014;157(3):636-650.Cell2014;157(3):651-663定义新的疾病亚型及其病因：脑桥小脑发育不全亚型10CLP1基因负责调控细胞中的tRNA代谢，其罕见突变引起一种以头围减小、感知和运动能力受损为特征的疾病,是一种新型的PCH亚型如果完全以患者症状或临床表现来定义疾病，是很难将这种新遗传病区分出来的。明确了致病基因之后，就看到了患者之间的共同特征。这与传统的疾病定义模式完全相反，代表了医学领域的一个转变目前五十四页\总数六十七页\编于三点EoE过敏症是一种可引起食道僵硬进而导致胃灼热和固体食物摄入困难的疾病。先前研究显示，EoE病人的一种未知过敏会导致嗜酸粒细胞这种可诱发炎症产生的白细胞在食道处聚集。新发现的易感基因CAPN14在食道中有特别的高水平表达，但在具有风险相关突变的个体中却是低水平表达NatGenet2014;46:895-900疾病机制：嗜酸性粒细胞性食管炎为什么局限于食道？目前五十五页\总数六十七页\编于三点解码基因组smORF假基因/重复基因lncRNA表观alleleSuper-enhancer远端调控元件Duons密码子多倍体目前五十六页\总数六十七页\编于三点利用CRISPR/Cas9饱和基因编辑和深度测序技术研究大量突变的功能影响Nature2014;513:120-123目前五十七页\总数六十七页\编于三点Hepatology2011;53:708-711ModelingandTherapyofHumanLiverDiseasesUsingiPScells目前五十八页\总数六十七页\编于三点Targetedgenecorrectionofa1-antitrypsindeficiencyiniPScellsNature2011;478:391-394目前五十九页\总数六十七页\编于三点疾病遗传变异研究的意义疾病机制（干预靶点）个体化医疗筛查、预测遗传纠正临床表型定量性状常见或者罕见致病变异及其基因功能分子通路药物靶点药物基因组毒理基因组发病机制诊断、分型新型疫苗个体化医疗目前六十页\总数六十七页\编于三点传染病：轻微/重症进展/非进展结核脑型疟登革休克综合征

Ebola病

Prion病…感染同样的病原体只有一部分人表现症状Why?感染的发生、发展和结局在人群中表现出巨大差异病原携带状态急性感染慢性感染隐性感染潜伏感染显性感染…目前六十一页\总数六十七页\编于三点2000年全军传染病研究所2007年传染病学国家重点学科2011年全军研究所复评为优秀2012年医院首批研究型学科、研究型团队

2012年全军新发与重症传染病研究重点实验室

2013年国家临床重点专科临床检验感染病专科医院专科实验室门诊病房实验室B超胃镜药观中心一病区二病区微生态中心发热门诊肠道门诊第三军医大学西南医院感染科目前六十二页\总数六十七页\编于三点目前主持和作为骨干承担课题9项，经费1550万课题来源编号经费国家自然科学基金重点项目81330038290万主持十二五传染病国家科技重大