重组蛋白表达系统第八章只做最高性价比

原核表达概总

2018

原核表达——载原核表达— 蛋原核表达——原核表达——实例演酵母表达系统概昆虫细胞表达系统概哺乳动物细胞表达系统概第八

哺乳动物细胞表达系统概哺乳动物细胞表达——细胞哺乳动物细胞表达——表达载哺乳动物细胞表达— 转入方高效表达外源蛋白的

2018哺乳动物细胞表达系统简

2018 与其他系统相比,哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠,提供复杂的型糖基化和准确的型糖基化等多种翻译后加工功能,因而,表达产物在分在过的几十 , 利哺乳物细表达统高表达组蛋的研取得了令人目的。前, 哺乳动物细胞表达系统不仅己经成为多种 工程药生产而且在新 能的现、白质结构功能究中起了为重要的作用。哺乳动物细胞表达系统研究现

2018哺乳动物细胞表达系统优缺

2018++-++++++++-+++-+++--++

2018

2018BHK-21

CHO-K1

2018C123

MDCK

2018Namalwa

2018 COS 获得3个细胞系:COS-1，-3和-7。它们被广泛用于瞬时表达系统。原因是：1，COS

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2018有多种细胞可供选择 有一 资助的专门提供细胞的机构ATCC（AmericanTissueCellCollection）（一）常用于稳定表达的细来源于小鼠的L-细胞、Ltk-细胞和NIH3T3细胞，都是极为常用的用于研究功能的细胞系。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2／0和NSO等来自于分泌型细胞，并且可在无培养基中生长，因而非常适合

2018二）常用于瞬时表达的细被导人外 ，并进行瞬时表达 洲绿猴细胞株CV－l。在这些细胞中，转染含SV40起始子的质粒后，SV40起始子与SV40T一抗原的结合可导致转染质粒在外大量。HEK293（humanembryonickidney293）是一种来自于转化有5型人类腺DNA的人胚胎肾脏细胞的细胞株，后者含有腺E1A，可激活带CMV启动子

2018（三）哺乳动物细胞的选 由是研 表达在此研究中，细胞的选择是非常关键的。如，β－globin基在Hela细胞中可以低水平表达但不可被诱导，但在MEL细胞分化过程中可以被诱导 ，MEL细胞应该被选择用来研究其诱导机制。因此，应将 导人适合研究的细胞而不单是易于转染的细胞株。如，CHO细胞常用于生产大量的蛋白质；而对于瞬时转染，COS细胞则比较合适；HEK293既是理想的建立稳定转染细胞的选择，也适合用于瞬时转染。

2018哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些或其他一些物种及人的表达调控序列。目前有多种质粒载体可供选择。典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件:(1)启动子和增强子；(2)多聚腺拷贝数的扩增系统如：细菌抗生素选择标记(Ampr)和用于质粒扩增的子（具有原核作

2018同细胞中，各种启动子的强弱不是一成不变的。人巨细胞（CMV）启动子是目前应用最广泛的启动子，而延长因子1（EF－l）启动子是迄今为止启动转录能力最强启动子，可使获得快速高效的表达。启动 来 强EF- 人延长因子 人巨细胞立 肉瘤 SV40 猿猴40晚 SV40 猿猴40早

注：为便于比较，将SV40early启动子的强度设定为1，

2018多聚腺苷酸化位点：多腺苷酸（P0lyA）化信号一般由位于多腺苷酸化位点上游11－30保守序列AAUAAA和一个下游的GU-或U-富含区组成，它指导PolyA尾的形成，增加mRNA的稳定性，从而保证表达的效率。PolyA聚合酶自U之后将切断，并加PolyA。如启动子一样，也有多个种类PolyA区供选择。哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸牛生长激3SV40猿 牛生长激3SV40猿 40晚2单纯疤 腺激SV40猿 40早1Hep表面抗1

注：为便于比较，将SV40early区与其比较得出强度相对值。数值越大，说明多腺苷酸化效率越

2018 APH灭活

2018药物选择标记：由于外源整合人细胞中的几率非常低，因此用致死性物的抗性来筛选稳定整合的细胞就显得非常重要。在一般的转染中，约1个细胞中有个稳定转染体（效率因细胞种类和转染方法而异）。常用的而且相对有效的选择标①APH或neor：新霉素、庆大霉素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷（gellticin，418)可以干扰真核细胞核糖体的功能而蛋白质的合成，进而导致细胞。APH或使G418去毒性，而使细胞可以在含有G418的培养液中存活。G418应溶于100mmol／LHEPES（pH4）溶液中，制成100×液备用。不同细胞对G418的敏感性不同，应该在转染前，先确使用终浓度，就是使所用细胞完全的最小剂量。

2018②ADA 编码腺苷酸脱氨酶（adenosine ADA）。Xyl－ 2’－ deoxyconformycin（dCF）组成。其中的dCF是一种 ③博来霉素抗性 ：这种 编码一种 kDa的蛋白，它可与 bleomycln。phleomycin和④HPH：HPH编码潮霉素B磷酸转移酶（hygromycinBphosphoptransferase，HPH）。hygromycinB通过干扰细白质合成中的转位以及促进错误翻译等机制抑制蛋白质的合成，从而导致细胞在10－400μg／mlHygromycinB的完全培养基中。过量表达HPH的转染细胞通过使HygromycinB磷酸化而使其灭活，使细胞在HygromycinB选择培养基中仍然存活

2018⑤(hnee)及T的筛选：受体细胞必须是相应的hprt在含HAT（H：hypoxanthine黄嘌呤，A：aminopterin氨甲喋呤，T：thiymidine胸苷）的培养基中。在A存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。这三中核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk或hprt的存在细胞才可生长。⑥黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)：哺乳动物细胞没有XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可通过IMP生产GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而。将含XGPRT的重组体导入真核细胞后，能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP补救合成GMP，使DNA合成正常进行。加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，克隆受霉酚酸的抑制则，以此来筛选阳性克隆。需要注意的是，无论使用何种选择标记，都要通过预实验对所使用的细胞确定适当的药物浓

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2018报告：用于转染细胞稳定表达的报告系统的出现和筛选方法的发展又推动了转染技术的发展。1982年,Gorman等建立了氯霉素乙酸转移酶（chiomphenicolCAT）报告系统和相应的CAT检测方法。研究者利用该系统将 的调节序列克隆到报的上游，然后观察报告在调控序列控制下的表达情况。这一技术的出现大大推动了对启动子机制的研究。继CAT报告系统，人们又先后建立了多种报告系统，其中包括荧光素酶、β一半乳目前的细胞内的调控研究、蛋白表达和功能分析以及转生物和治疗都得益于转移表位：为方便表达蛋白的鉴定或纯化，人们建立了一些含有表位（epitopetags）的融合表达载体。常用的表位有：GST、人IgG1的Fc区、FLAG（DYKDDDDK）、HA（YPYDVPDYA）、（His）6（HHHHHH）和C－myc（EQKLISEEDL）等等。表位在目的蛋白的氨基端，也可以放在羟基端。表位

2018依据质粒在宿主细胞内是否具有自 能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类整合•••••游离••••

可持续表达外安全性低：插入诱SV40载体，逆转 载体， 载体腺相 载不整 载体，痘 载

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2018 有牛生长激素(BGH)多腺苷酸化号。在此载体基础上。又衍生出多种适合各种不同要求的载体，

2018pSI：该质粒出自Promega公司。含SV40增强子／早期启动子区，在其下游还有珠蛋白／嵌合内含子，可进一步增强表多腺苷酸化信号为晚期SV40用于瞬时转染稳定转染。该载体本身不含选择记，若用于稳定转染，必须与含选择标记

2018pCMV-HA：pCMV-HAClontech公司产品，该质粒载体CMV 19 SV4016SmRNA内含子

2018pBudCE4.1：是Invitrogen公司的一个双启动子（CMV

2018（4）pBudCE4.1：是Invitrogen公司的一个双启动子（CMV

2018诱导表达载体系统 原理是：首先用pTet－off（或pTet－On）转染靶细胞并建系，这种建系细胞表达一种由源于四环素抑 （HSV）VP16蛋白转录激活结构域融合而成的调节蛋白，为 被置于族的四环素反应元件（TRE）的调控之下。对于Tet－Off系统，在没有Tet或DOX时，从pTet一载体上表达的tTA蛋白通过结合pTRE载体上的TRE元件，激活目的 的转录，而加入t或DoX后，它们即可与tTA发生相互作用，使后者不再能结合TRE，目的 的表达被封对于Tet－On系统,PTet－On载体上表达的 TetR序列区改变了四个氨酸，因此在环境中不存在Tet或Dox时，它不能与TRE元件结合， 不能表达，只有加入Tet或Dox后，被Tet或Dox修饰的rtTA才能与TRE结合，启动目的 的表

2018pTet-Off（pTet-On）系统载体图

2018（二）型载型载体已被广泛地用于将外源导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷将来在治疗中将具有非常重要的价目前应用的类型包括：逆转录（retro）、腺（adeno）、腺相关－associated）、牛痘（Vaccinia）和杆状（baculo）等等逆转录载体逆转录是RNA，进人处于增殖状态的细胞后，在细胞过程中反转录成DNA并整合人宿主组，整合的可以被传至子代细胞，并在细胞中表达目的蛋白。逆转录的优点是，可以使外源整合到组中，因而可以被稳定传代和表达。从另一角度讲，这一点也是它的缺点。由于逆转录的插入位点是随机的，因而在组内的整合有可能破坏一些内源基因的结构，尤其是当插人到一些重要的位点时会导致细胞的异常。

2018很多生物技术公司提供有多种逆转录载体。这里以Clontech公司的pLNCX为例说明逆转录载体的基本结构。载体pLNCX含有来目M01oney小鼠白血病（murineleukelnia和Moloney小鼠肉（murinesarvoma）的一些元件，另外还有些元件来自于细菌质粒pBR322。这些元件包括：①来自于pBR322的ColE1起始子和ampr基，使得载体可以在大肠杆菌中和被筛选；②5’和3’端长末端重复序列（1ongterminalrepeats,R）可以促进基因的整合;③5’端LTR里启动子及增子序列，控制中ф+序列和HygromycinB抗性的达；④多克隆位点；⑤人巨细胞立早启动子（PCMVIE），负责启动外源的表达。将逆转录载体转染入包装细胞株ackagingcellline）后，它可瞬时或稳定表达含转有病色装信号、HygnmycinB抗性和目的的录本，并由包装细胞组表达的结构蛋白质，装配成具有一次能力的颗粒。 载体 Clontech公司的pAdeno－XVialDNA、Ptre-Shuttle载体和Qiagen公司的 DNA的大部分序列，它在转染细胞后，可直接得到具备 ，

2018 野生 可定点整合人类19 长臂 表达稳定 可在最邻近 启动子的控制下高效表达。然而由于牛 组较大，体外DNA重组 载 生物学特

2018 AAV载体单链HSV载体

裂细胞 在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组

Ex 肿 In 肿 。In Ex 获得性慢性疾病的神经系统疾病的 肿瘤

2018 腺 结

2018 细胞过

2018 组

2018 组DNA全长36kb，其包装上限为原 组的105%，DNA两端各有 的调控因子，L1-L5为编码 。E3区缺失只会影 使得载体的装载量提高到4kb 载

2018转移载

2018表达载

2018 DNA载体的特

2018期

2018 SV40属于乳多 科多 属，呈小型二十面体，由、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成 组为5224bp的双链环而使其DNA形成类似核小体的微 结构 SV40 组t/ 期状态时，每个宿主细胞含有105个

20182SV40DNA-质粒DNA杂合载体的构

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肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt

利用SV40DNA载体表达外 的程

2018 SV40

缺陷的SV40SV40DNA载体的特

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2018人乳多 人乳多 表达载体的构删除编

BKV

BKV

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SV40 安装细胞色素P450dioxin介导的增强

Ap子DRE，控制小 启动子MMTP，由其带动外 SV40来源的启动子控制Neor标 人牛

2018人牛 是一个大型 细胞质中自 。以前外 插 组的非必需区内，构 启动子的控制下高效表达。然而由于牛 组较大，体DNA重组 ，因此通常采用体内重组的方式进行人牛 DNA表达载体的构

2018目前广泛使用的牛痘表达系统是一种预先构建好的重其组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码。在外源导入受体细胞之前，先以上述的重组 量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源整合在受体细胞人囊状纤维化就是采用这种战略高效表达的。利用人牛 载体表达外 的程

2018 牛 T7启动 聚合

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2018前面介绍了一些常用的哺乳动物细胞表达载体及多种表达载体的功能元件，那么，在具体择载体的时候，哪些因素需要考虑呢？以下几个问题也许能提示你选择出恰当的载体。表达蛋白质的目的是什么如果你需要检测或纯化目的蛋白质，应选择能表达含附加肽的融合蛋白表达载如果需要将蛋白分泌出来，应选择有分泌信号的载体若需要表达天然蛋白，应挑选不含附加多肽或选择在N一端有可切除附加多肽序列的载如果需要一次达几种蛋白质，你可以采用两种含不同抗药标记的载体，或者选用含两个启动子及两个多克位点的单一载体。 、荧光素酶 和β一半乳糖苷 等

2018或供重组融合蛋白纯化用的多组氨酸（6×HIS）或GST等。如果你所表达的蛋白质需要天然的用绿色荧光蛋白（greenfluorescentproteinGFP）融合载体，其得到的绿色荧光蛋白融合

2018不同载体有不同的启动子，同一启动子在不同的细胞中也会有不同的活性强度。如果你不知道哪种启动子适合于你所选的细胞，则应先进行文献检索，看看别人应用这种细胞或类似细胞进行蛋白表达的情况，也可以通过网络检索有关试剂公司，它们常会提供相关的信息。万一你外源有些载体（尤其一些载体）对插入片段的大小有严格要求，不能容纳太大的外源

2018转染技术在初期时发展相当缓慢，分子生物学技术，特别是质粒DNA克隆技术的进步极推动了转染技的进步。现在人们可以轻而易举地大 高纯度的DNA和RNA，但同时要求有更高效率的转染技术的细胞种类。由此，人们发明了电穿孔和 介导的技术对外源 转染方法的要求包括：转移效率高，不影响细胞的正常生理活动，低毒性，容易使用，重复性好，易获得稳定转化子。根据转染的机制不同可将转染法分为化学转染法和物理法两大类。（一）化学转染化学转染法包括DEAE一葡聚糖法、磷酸钙法和人工 法等。目前应用最广泛的是人 法DEAE-葡聚

2018人工脂法具有较高的转染效率 目前已有Invitrogen、Promega、Clontech和Qisgen等多家公司生产的脂 转染试剂。读者以从公司网页上找到所需的试剂及操作程序。人工脂 转染的具体方法因不同试剂公司品而异，请参照所购试剂说明书进行。（二）物理方包括电穿孔、显微注射 枪等方法四种常用哺乳动物细胞电穿 转染缓冲①不含Ca2+或Mg2+的

2018②HEPS（137mmol／LNaCI，5mmol／LKCI、0.7mmol／LNa2HPO4，6mmol／L右旋葡萄糖、21③ 培养④蔗糖一磷酸缓冲液272mmol/L蔗糖、7mmol/LK2PO4(pH至7.4)、1电穿孔法常用来转染如植物原生 等常规方法不容易转染的细胞。关于电穿孔技术用于 导人的 始见于1982年（Whng等）。其作用原理是，利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。显微注射

2018 枪该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体需要注意的是，没有法是万能的，应根据具体情况进行选择。但无论选用何种转染方法，DNA的质量和数量对转染成功与否至关重要。用于转染的质粒DNA必须没有蛋白质。RN和其它化学物质污染，可用CSCI梯度离心、柱层析法或质粒DN提取试剂盒DN。吸光度A260nm与A280nm的比值应在1.8－1.9之间。转染前用乙醇沉淀DNA，再加人适量灭菌水或TE缓冲液溶解DNA，至终浓度为1mg／ml左右。对于不同的细胞，质粒DNA转染所需的量不同，因此在实验开始以DN的比例，转染DN在（三 率、可稳定遗传、适用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。但多 有其潜在 性，操作者需要有一定操作经验和良好的设施 表达系统内容十分丰富，其应用已越来越广泛高效表达外源蛋白的基本方(1)高效表达外源蛋白的基本方目的在哺乳动物体、目的和宿主细

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2018高效表达外源蛋白的基本方(1)

2018扩增是外源在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多数细胞，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhf均得以扩增。这些抗性细胞正是通过增加相关的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于dhf本身，即与dhf高效表达外源蛋白的基本方

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0.05mM0.25mM

转染dhfr-细胞系5mMMTX外 高效表达外源蛋白的基本方

2018 高效表达外源蛋白的基本方通过选 的弱化表达增加拷贝

2018具体实例：将选择通过一段寡聚核苷酸连在目的的3′端（如图）