三黄鸡唾液酸转移酶基因组织学表达和分布的研究

PAGEPAGEII三黄鸡唾液酸转移酶基因组织学表达和分布的研究 摘要唾液酸（sialicacid，SA）是神经氨酸的衍生物，分布于细胞表面。在流感病毒感染机体的细胞时，流感病毒的凝集素（HA）首先与其受体唾液酸结合，介导流感病毒进入细胞并完成在细胞内复制的过程。禽流感病毒倾向识别α-2,3唾液酸受体(NeuAcα-2,3-Gal)，而人流感病毒倾向识别α-2,6唾液酸受体(NeuAcα-2,6-Gal)。唾液酸受体是由磷酸烯醇丙酮酸与N-乙酰甘露糖胺-6磷酸在胞质中缩合成9-磷酸-N-乙酰神经氨酸或与6磷酸甘露糖缩合成9-磷酸去氨基神经氨酸为骨架而来的。在唾液酸生物合成的过程中，唾液酸转移酶（sialyltransferase,ST）是唾液酸形成的限速酶和结构确定的关键酶，它催化α-2,3和α-2,6键的形成。三黄鸡是华南地区最重要的优质肉鸡品种，也是禽流感综合防控压力极大的肉鸡品种之一。为研究流感病毒的侵入起始阶段唾液酸转移酶发挥的作用，我们克隆了三黄鸡的7个唾液酸转移酶（ST），并通过半定量检测了唾液酸转移酶mRNA在各组织的分布情况；通过对ST3Gal=3\*ROMANIII亚型ORF克隆与原核表达，成功制备了多抗血清，并通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学确定三黄鸡ST3GalIII的mRNA和蛋白的表达水平；同时，在真核293T细胞系细胞中表达了ST3GalIII，为ST3GalIII在疾病的发生与发展过程中的作用提供了基础数据。本研究共分为5部分内容：1、三黄鸡ST基因的克隆及序列分析以三黄鸡肝脏总RNA为模板，运用RT-PCR方法扩增了三黄鸡ST的7个亚型基因，并将其克隆到pMD18-T载体中进行测序，运用分子生物学软件对所获得的序列进行了分析。结果表明，所克隆的三黄鸡ST3Gal=1\*ROMANI基因约1085个核苷酸ADDINNE.Ref.{E8BE6D32-4942-4564-AD9C-C67AF109B2F9}，ORF长1029

bp，编码342个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约40kDa；ST3GalIII基因约1145个核苷酸ADDINNE.Ref.{5E2D7D77-2D02-45BD-BB1E-01FC9DBF09DE}，ORF长1077

bp，编码358个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约40kDa；ST3Gal=4\*ROMANIV基因约1066个核苷酸ADDINNE.Ref.{7CA8224A-9362-4613-BF31-1DFE3F367848}，ORF长1008

bp，编码335个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约38kDa；ST3Gal=5\*ROMANV基因约1138个核苷酸ADDINNE.Ref.{B717E843-216D-428C-BB3B-2AE964B9A92E}，ORF长1107

bp，编码368个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约40kDa；ST3Gal=6\*ROMANVI基因约1169个核苷酸ADDINNE.Ref.{92E450D7-8FCD-4103-A3FB-08C1D13981D2}，ORF长990

bp，编码329个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约38kDa；ST6Gal=1\*ROMANI基因约1400个核苷酸ADDINNE.Ref.{6CBB991E-005B-481D-BFA3-01D83827092F}，ORF长1242

bp，编码413个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约47kDa；ST6Gal=2\*ROMANII基因约1825个核苷酸ADDINNE.Ref.{3B229CCD-8302-471D-B8DF-8D8F638374E1}，ORF长1590

bp，编码529个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约61kDa。同时将所克隆的ST基因与已报道的人，黑猩猩，牛，猪，小鼠相应序列作比较，发现其核苷酸序列的同源性不高，并通过生物学软件预测了所克隆的ST基因蛋白的特点。对三黄鸡这写获得的基因提交GenBank，获得的acc.No分别是：JX035875(ST3GalI),JX035876(ST3GalIII),JX035870(ST3GalIV),JX035871(ST3GalV),JX035874(ST3GalV),JX035872(ST6GalI),JX035873(ST6GalII)。2、三黄鸡ST基因表达的半定量和荧光定量分析以三黄鸡各个组织中总RNA为模板，运用RT-PCR方法扩增了三黄鸡ST基因和β-actin基因，并将其纯化后进行测序。半定量结果显示：ST3GalI基因在心脏中表达量高，在法氏囊中表达量低；ST3GalIII基因在肾脏中表达量高，在法氏囊中表达量低；ST3GalIV基因在法氏囊中表达量高，在肺中表达量低；ST3GalV基因在肺脏中表达量高，在胸腺中表达量低；ST3GalVI基因在肾脏中表达量高，在肺中表达量低；ST6GalI基因在心脏中表达量高，在脑中表达量低；ST6GalII基因在胸腺中表达量高，在肝脏中表达量低。ST3GalIII的荧光定量结果与半定量一致。3、三黄鸡ST3GalIII的原核表达与多抗的制备以含有三黄鸡ST3GalIII基因的重组质粒pMD18-T-ST3GalIII为模板，扩增带有BamHI和SalI酶切位点的基因片段，亚克隆至表达载体PET32a(+)，成功构建了原核表达质粒PET32a(+)-ST3GalIII，转化宿主细菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，SDS分析后，将目的蛋白割胶纯化并以此纯化产物制成油乳剂免疫家兔，制备兔抗鸡ST3GalIII多克隆抗体。双向琼脂糖凝胶扩散和间接ELISA法测得抗体效价较高。Westernblot结果表明，抗体有较高的特异性。获得了效价高，特异性好的兔抗ST3GalIII多克隆抗体4、三黄鸡ST3GalIII蛋白的免疫组织化学分析利用免疫组织化学技术对ST3GalIII蛋白在三黄鸡各个组织的分布进行了研究，结果表明，ST3GalIII蛋白在三黄鸡的检测组织内除了肾脏，脑，胸腺外均有不同程度表达和分布。ST3GalIII蛋白在肺的气管，支气管，肺泡上皮都有分布；心肌细胞呈现中强阳性表达，然而心肌间质却是阴性；肝细胞为中阳性，肝血管与肝窦内皮细胞为阴性；脾脏，阳性细胞主要分布在脾小体的一些脾细胞和内皮细胞中；法氏囊，阳性细胞主要集中在皮质，而髓质为弱阳性。然而在肾、大脑和胸腺没有检测到ST3GalIII蛋白。5、PIRES2-EGFP-ST3GalIII真核表达载体的构建及其在293T细胞中的初步表达含有三黄鸡ST3GalIII基因的重组质粒pMD18-T-ST3GalIII为模板，扩增带有XhoI和Sac=2\*ROMANII酶切位点的基因片段，经酶切纯化后再将其亚克隆到带有加强型绿色荧光蛋白报告基因的pIRES2-EGFP真核表达载体中,对重组质粒pIRES2-EGFP-ST3GalIII进行酶切和测序鉴定后,采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到293T细胞,荧光显微镜观察其表达情况。结果表明,真核表达载体pIRES2-EGFP-ST3GalIII构建成功并可以在293T细胞中表达。该表达载体可以作为研究ST3GalIII蛋白生理功能的重要工具。关键词：三黄鸡；唾液酸转移酶；表达；免疫组织化学Tissue-specificExpressionandDistributionAnalysisofChineseChickenSialyltransferaseGeneZhouFei(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthernChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract:sialicacid(SA),onekindofderivativeofneuraminicacid,whichwidelydistributeonthesurfaceofthecell.Sialicacidplaysanimportantroletothephysiologyandbiochemistryofthebody,andwasrelatedtothediseasedevelopment.TheHemagglutinin(HA)oftheinfluenzaviruscanbecombinedwiththeoligosaccharidescontainingsialicacid(SA)inhostcellwhichistheinitialphasewhentheinfectionoccurred.ThatiswhytheSAwasregardedtobethereceptoroftheinfluenzavirus.Itiswidelybelievedthattheavianinfluenzavirus(AIV)preferredtosialicacidscontaininganα-2,3-linkagetothepenultimategalactose(SAα-2,3-gal)andhumaninfluenzavirusespreferreceptorsthatcontainanα-2,6linkage(SAα-2,6-gal)astheirreceptorsintheentryofintocells.Astheglycosyltransferases,sialyltransferasesuseCMP-Neu5Acasanactivatedsugardonorandaddsialicacidtotheterminalportionsofthesialylated

glycolipids(gangliosides)ortotheN-orO-linkedsugarchainsof

glycoproteins.Tillnow,therearejustafewreportsaboutthesialyltransferases,soweclonedtheChineseyellowchickensialyltransferasesgeneandstudiedtheexpressionprofileandproteinexpression,sothesedatacanprovidethebasicdataforunderstandingthefunctionofthesialyltransferasesandfurtheranalysistheinfluenzareceptorintissuesoftheanimals.Therearefivepartsofthisstudy:ThecloningandanalysisofthechickenSTgeneTheSTgenesinyellowchickenwereamplifiedbyRT-PCRfromthetotalRNAextractedfromliverastemplates.ThegeneweresequencedafterclonedrespectivelytothevectorpMD18-Tandanalyzedwithmolecularbiologysoftware.TheresultsshowedthattheST3Gallgenewas1085nucleotideslong,encoding342aminoacidresidues,molecularmasswasofapproximately40kDa;ST3GalIIIgenewas1145nucleotideslong,encoding358aminoacidresidues,molecularmasswasofapproximately40kDa;ST3GalIVgenewas1066nucleotideslong,encoding335aminoacidresidues,molecularmasswasofapproximately38kDa;ST3GalVgenewas1138nucleotideslong,encoding368aminoacidresidues,molecularmasswasofapproximately40kDa;ST3GalVIgenewas1169nucleotideslong,encoding329aminoacidresidues,molecularmasswasofapproximately38kDa;ST6Gallgenewas1400nucleotideslong,encoding413aminoacidresidues,molecularmasswasofapproximately47kDa;ST6GalIIgenewas1825nucleotideslong,encoding529aminoacidresidues,molecularmasswasofapproximately61kDa.Comparedwiththecorrespondingsequenceofthechicken,human,rat,pig,cattleandpongo,ithassharethelowhomology.AllthesequenceswereuploadedtotheNCBIbank,andtheaccessNO.sare:JX035875(ST3GalI),JX035876(ST3GalIII),JX035870(ST3GalIV),JX035871(ST3GalV),JX035874(ST3GalV),JX035872(ST6GalI),JX035873(ST6GalII)Semi-quantitativePCRandReal-TimequantitativePCRanalysisoftheSTgeneTheSTgenesandβ-actingenewereclonedformthetotalRNAofyellowChinesechicken.Thesequencesweresequencedafterpurified.ThesemiRT-PCRresultsshowthat:theexpressionofST3GalIgenewashighintheheartwhilewaslowinthebursaoffabricius;theexpressionofST3GalIIIwashighinthelungwhilewaslowinthethymus;theexpressionofST3GalIVwashighinthebursaoffabriciuswhilewaslowinthelung;theexpressionofST3GalVwashighinthelungwhilewaslowinthethymus;theexpressionofST3GalVIwashighinthekidneywhilewaslowinthelung;theexpressionofST2Gal1washighintheheartwhilewaslowinthebrain;theexpressionofST6GalIIwashighinthethymuswhilewaslowintheliver.TheReal-Time-PCRanalysisofST3GalIIIgeneshowthattheresultmatchtheresultofthesemiRT-PCR.ProkaryoticexpressionoftheST3GalIIIandthepreparationofthepolyclonalantibodyTheST3GalIIIgenewithreSTrictionenzymecuttingsitewasclonedformthepMD18-T-ST3GalIIIplasmid.ThenthegenewassubclonedintothePET32a(+)plasmid.AftertransformedintotheE.coliBL21(DE3),thepositivecloningwasinducedbytheIPTG.SDSandWeSTern-blotresultsshowedthattheST3GalIIIproteinofchickenwasexpressedintheformofinclusionbody.TheNewZealandWhiterabbitswereimmunebythepurifiedexpressionproteintoproducepolyclonalantibody.TheimmunohistochemicalanalysisofST3GalIIIinyellowchickenThemethodofimmunohistochemiSTrywasprimarilyestablishedtodetectthedistributionofST3GalIIIinChineseyellowchickentissuesandtheresultsshowedthatST3GalIIIproteinhavedifferentlevelsofexpressionanddistributioninthedetectedtissuesofthechicken.Theresultsshowthattherespiratoryregionofthelung,theciliatedandnonciliatedcellsofthebronchiandbronchiolesandalveolarepithelialcellswerepositive.Thecardiomyocytesoftheheartwerestronglypositive,whereastheconnectivetissuesbetweenthemusclecellswasnegative.Intheliver,Hepatocytesweremoderatelypositive,theendothelialcellsofthebloodvesselsandhepaticsinuswerenegative.Inthespleen,onlyaverysmallpartofsplenocytesandsomeendothelialcellswerepositiveinthespleniccorpuscle.Inthymus,theepitheliareticularcellswerediffuselymediumtoSTrongpositive,onlyaverysmallportionofthymocyteswerepositive.Inthebursafabricius,mucosalepitheliumcells,lymphocytesandepithelialreticularcellinthecortexthefollicularwerestronglypositive,partofthelymphocytesinthemedullaareaofthefollicularwereweakpositive.Therearenodetectioninkidney,brainandthymus.TheconstructionofthePIRES2-EGFP-ST3GalIIIvectorandtheexpressionoftheST3GalIIIin293TcellTheST3GalIIIgenewithrestrictionenzymecuttingsitewasclonedformthepMD18-T-ST3GalIIIplasmid.ThenthegenewassubclonedintothePET32a(+)plasmid.Then,thepositiveclonewastransfectedinto293Tcellbyliposomes.TheexpressionoftherecombinantpIRES2-EGFP-ST3GalIIIinthe293Tcellswasobservedbyfluorescencemicroscope.TheresultsshowedthattheST3GalIIIofpIRES2-EGFP-ST3GalIIIwassuccessfullyexpressedinthe293Tcells.Keywords:Chineseyellowchicken,Sialyltransferase,expression,immunohistochemistryPAGE2目录1前言 12材料与方法 52.1材料 62.1.1实验动物 62.1.2菌株和质粒 62.1.3主要试剂盒及试剂 62.1.4主要溶液的配制 82.1.5主要仪器设备 92.1.6分析工具软件 102.2方法 112.2.1鸡ST基因的克隆 112.2.2三黄鸡ST基因半定量实验 182.2.3三黄鸡ST3GalIII基因荧光定量实验 202.2.4三黄鸡ST3GalIII基因的原核表达与多抗的制备 242.2.5三黄鸡ST3GalIII基因的组织学分布 282.2.6PIRES2-EGFP-ST3GalIII真核表达载体的构建 303结果与分析 313.1三黄鸡ST基因的克隆与序列分析 313.1.1三黄鸡ST基因的克隆与质粒的鉴定 313.1.2三黄鸡ST基因的序列分析 323.2三黄鸡ST基因半定量和荧光定量结果与分析 343.2.1三黄鸡ST基因半定量实验结果与分析 343.2.2三黄鸡ST3GalIII基因荧光定量实验结果与分析 393.3三黄鸡ST3GalIII基因的原核表达与多抗制备 433.3.1原核表达载体构建结果 433.3.2三黄鸡ST3GalIII蛋白的诱导表达及纯化 443.3.3重组蛋白的纯化 453.4三黄鸡ST3GalIII基因的组织学分布 473.4.1ST3GalIII组织学分布结果 473.4.2结果分析 473.5三黄鸡ST3GalIII的真核表达 493.5.1PIRES2-EGFP-ST3GalIII重组质粒的鉴定 493.5.2重组表达质粒转染结果 493.5.3真核表达的WB验证结果 503.5.4结果与分析 504讨论与结论 50致谢 53附录A 57附录B 581前言唾液酸(Sialicacid)是一类神经氨酸的衍生物，随着对唾液酸生物学功能研究的逐步深入，人们发现唾液酸是流感病毒的受体并随之开展了大量的研究ADDINNE.Ref.{75359724-0631-4A17-899C-AC4B0AC029DC}（Viswanathanetal,2010）。这些研究集中于流感唾液酸受体的生物代谢和嗜性、流感病毒血凝素（Haemagglutinin，HA）的变异及其与唾液酸结合特性、流感唾液酸受体在流感跨物种传播中的作用，以流感唾液酸受体为核心的流感防控研究上ADDINNE.Ref.{4949092D-B657-4CF6-9747-D9AE205E2688}（侯小强等，2009;时瀚等，2010;李绍顺，1997）。这些研究试图阐明流感病毒及其唾液酸受体之间的相互作用，为流感的综合防控提供科学依据。本文对流感唾液酸受体的相关研究进行综述，为流感致病机制研究和综合防控技术的研发提供基础材料。1.1流感唾液酸受体的生物代谢和嗜性流感唾液酸受体是由磷酸烯醇丙酮酸与N-乙酰甘露糖胺-6磷酸在胞质中缩合成9-磷酸-N-乙酰神经氨酸或与6磷酸甘露糖缩合成9-磷酸去氨基神经氨酸为骨架而来的（图1）ADDINNE.Ref.{743A40F1-83DC-47BC-ABB6-5A9162EFE5BE}（Corfieldetal,1976;Varki,1992;Travingetal,1998）。在这个起始于葡萄糖的长链反应中，最关键的调节酶是差向异构酶，它能将UDP-N-乙酰葡萄糖胺催化成6-磷酸乙酰甘露糖胺ADDINNE.Ref.{2B9F9959-F7DD-4EB7-8999-DE3C707FCCE8}（Chenetal,2002）。之后，去磷酸化的单糖被转入细胞核内被激活成CMP-糖苷。在反应链中，CMP-N-乙酰神经氨酸可以在CMP-N-乙酰神经氨酸羟化酶的作用下生成CMP-N-羟乙酸神经氨酸。之后，CMP-N-乙酰神经氨酸和CMP-N-羟乙酸神经氨酸被特定的载体运送到高尔基体中并递呈给唾液酸转移酶ADDINNE.Ref.{65814E98-3BD7-494E-B798-58F9497BFCD2}（Malykhetal,2001）。唾液酸转移酶将唾液酸转移到糖蛋白或脂蛋白上，最后以胞吐的形式定位于细胞外膜上并发挥相应的生物学功能ADDINNE.Ref.{99CB7C20-3CF8-424D-A788-63C1A1074CFB}（Schlenzkaetal,1994）。随着生物体的新陈代谢和外界的刺激，存在于胞膜上的唾液酸会被降解。唾液酸的降解通常由细胞间和细胞内的唾液酸酶催化从而使唾液酸脱离糖蛋白或脂蛋白成为游离的唾液酸，被修饰了的唾液酸对唾液酸酶的亲和力比没被修饰的唾液酸差，所以前者得在相应的酯酶的作用下脱掉取代基再和唾液酸酶作用ADDINNE.Ref.{AA9393C9-5BF5-4604-8FAA-3D586883BDC4}（Tiralongoetal,2003）。唾液酸不仅能在细胞外被降解，同时他还能以胞吞的形式被运输到溶酶体中，以同样的催化方式降解。降解而产生的唾液酸也可以再次被利用与糖蛋白或脂蛋白结合而送到细胞膜上ADDINNE.Ref.{284F3B5B-04DE-4248-AE1D-816B69DDC7D7}（Schauer,2004;Engstleretal,1995）。图1.唾液酸的生物合成图不同的唾液酸转移酶对糖链有不同的嗜性。据研究报道，人类基因组中有20个STs基因,介导唾液酸以α-2,6糖苷键连接到半乳糖上的是ST6Gal转移酶,介导唾液酸以α-2,3糖苷键连接到半乳糖上的是ST3Gal转移酶。其中,编码ST6Gal转移酶的基因有两种(ST6GalⅠ和Ⅱ),均对Ⅱ型聚糖链(Galβ1,4GlcNAc2R)发挥作用；编码ST3Gal转移酶的基因有6种(ST3GalⅠ-Ⅵ),其中ST3GalⅠ和Ⅱ能偏嗜Ⅲ型糖链(Galβ1,3GalNAc2R),ST3GalⅢ、Ⅳ、Ⅵ能使Ⅱ型糖链(Galβ1,4GlcNAc2R)唾液酸化,ST3GalV使Galβ1,4GlcNAc2Cer唾液酸化ADDINNE.Ref.{AAFC68B7-BDBC-4514-9D2F-E97A6C01EED5}（丛彦龙等，2009;Harduin-Lepersetal,2005）。根据糖链的结合位点不同，可分为SAa-2,3Gal与SAa-2,6Gal唾液酸受体ADDINNE.Ref.{2D1324FD-2337-4256-B983-83D5EDFDD233}（Ningetal,2009;Matrosovichetal,1997;Suzuki,2005）。SAa-2,3Gal受体是唾液酸与半乳糖的3位碳结合，而SAa-2,6Gal则是与半乳糖的6位碳相结合，这两种受体被认为分别是禽流感受体（SAa-2,3Gal)和人流感受体（SAa-2,6Gal)ADDINNE.Ref.{E275E899-1863-4D6F-80D6-F79C74291296}（Samyn-Petitetal,2000）。1.2唾液酸受体与流感病毒的相互作用流感病毒在侵入细胞的初期，流感病毒血凝素先与细胞膜表面的唾液酸受体相结合，随后引起病毒脂质膜和宿主细胞膜间的融合，从而病毒得以入侵细胞ADDINNE.Ref.{FBB92F5D-E9CF-42A2-9118-642E3CAE9DCC}（Driskelletal,2012;Luo,2012）。在病毒复制完成释放时，神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）水解糖脂和糖蛋白上的唾液酸，使新病毒从细胞中游离出来。流感病毒对唾液酸的分子类型和结合形式有明显的嗜性，人流感病毒优先与人呼吸道上皮组织上的α-2,6唾液酸半乳糖结合,禽流感病毒优先与禽肠道组织上的α-2,3唾液酸半乳糖受体结合ADDINNE.Ref.{E754442C-435D-4160-A746-EF70E75737D1}（郭潮潭等，2005）。这种结合方式的特异性是限制流感病毒跨越种属传播的一个重要因素。HA与唾液酸受体结合的特异性也会因为流感病毒HA的变异而发生改变。H3亚型病毒的HA上的第226位Leu变成了Gln之后，其嗜性从原来的SAa-2,3Gal变成了SAa-2,6Gal，但是变成Met时，其既能与SAa-2,3Gal结合又能与SAa-2,6Gal结合。2007年在香港流行的H5N1病毒其HA的226位就是Met，这也许是其感染人的一个重要原因ADDINNE.Ref.{36E68674-0C3E-4FD2-9C88-56E5D901C431}（张太翔等，2010）。ToshihikoSawada等人通过FMO实验从理论上验证了这个现象，但也有报道显示病毒的HA上第205位的Ser变成Gly之后，其嗜性也发生了逆转ADDINNE.Ref.{DE5D8E00-D83A-4DE5-9094-5C02E50AC516}（Suzukietal,1989）。让人费解的是导致西班牙流感的H1N1亚型能跨物种传播，但其226位氨基酸却没有发生改变，有人认为这可能是因为该病毒HA的结构被改变了从而实现跨物种传播ADDINNE.Ref.{872F3B5D-BE0F-40DB-8A2B-76DCD9C208F5}（Suzukietal,1989）。1.3唾液酸受体在不同物种组织学的分布及其在流感病毒跨物种传播中的意义不同的物种与同一个物种动物的不同组织，两类唾液酸受体的分布是不同的，这也许是造成不同亚型的流感病毒对动物和组织的偏嗜性的主要原因。不同类型流感唾液酸受体的组织学特异性分布和表达也许与病毒的跨宿主传播、宿主的特异性及不同类型流感病毒混合感染时的基因重组等有密切的关系ADDINNE.Ref.{6DB5725F-58A7-4649-AC3E-B90FC81A7DB5}（Rogersetal,1983;Herrleretal,1987;Rogersetal,1989）。Suzuki等用外源凝集素特异性选择和高速流层分析的方法,对各种宿主靶器官的唾液酸结合方式进行了调查分析,发现在野鸭肠道和马呼吸道的粘膜细胞里唾液酸以SAα2-3Gal结合方式存在；在人的呼吸道粘膜细胞膜上有Neu5Acα2-6Gal结合方式,而没有检测到SAα2-3Gal结合方式的糖链；在猪的上呼吸道粘膜细胞中,SAα2-3Gal和SAα2-6Gal结合方式的两种唾液酸都存在，基于这些研究工作，人们推测猪是自然界中介于人类和野鸭的流感病毒之间的中间宿主，人类或野鸭的流感病毒都能感染猪，在猪体内可能会引起人类和野鸭流感病毒的基因重组,从而产生变异的流感病毒ADDINNE.Ref.{665D4EFA-9892-45F2-9ECE-C32FA1592A55}（Kraussetal,2012）。为弄清流感病毒不同类型唾液酸受体的组织特异性分布与流感病毒感染、复制及对机体损伤之间的关系，人们对不同物种动物不同类型的流感受体的组织学分布进行了较多的研究。张增峰ADDINNE.Ref.{5490F1FE-3A4E-41EB-9872-7833BCD64ED1}（张增峰等，2010）等人研究了鹌鹑不同组织中SA受体的分布，结果表明，鹌鹑气管、支气管、副支气管、次级支气管和消化道结肠上皮细胞都有SAa-2,3Gal和SAa-2,6Gal的分布。SAa-2,6Gal和SAa-2,3Gal在多个不同组织中的分布具有明显的量的差异。马明ADDINNE.Ref.{DC5E1C84-19D3-439B-9F33-97E826FE857A}（马明等，2009）等研究了鸡、鸽和虎呼吸道和消化道流感唾液酸受体的分布，结果表明，鸡、鸽和虎的呼吸道和消化道的不同类型流感唾液酸受体在黏膜上皮的分布具有明显的组织和物种特异性。RahulKNelliADDINNE.Ref.{684792F4-2B74-487A-B3E2-E89537B68DBB}（Nellietal,2010）等对猪的SAa-2,3Gal和SAa-2,6Gal受体的分布做了研究，结果表明，不同类型唾液酸受体的分布在组织内呈现特定的规律，可能与流感病毒的感染与复制具有一定的关联性。NingADDINNE.Ref.{1F7296D8-D8A0-42BA-B0B4-0E9DAE1E424B}（Ningetal,2009）等对小鼠流感受体的组织学分布研究表明，不同类型流感受体的组织学分布具有典型的差异，推测这种差异性也许是流感病毒感染后组织学病变的基础。此外，流感受体的组织学分布也许会随着年龄的变化而发生相应的变化。SmithaPSPillaiADDINNE.Ref.{0B2731E4-638F-4582-940A-C9516C305881}（Pillaietal,2010）等报道，火鸡不同类型流感受体的组织学分布会随年龄的变化而变化。对于由流感病毒对唾液酸受体的偏嗜性而得出SAa2,6Gal是人流感病毒的受体SAa2,3Gal是禽流感病毒的受体这一论断现在已经引起了争议。Rogers等ADDINNE.Ref.{01D1A946-F127-4775-9461-D4D3DF0BFD41}（Zhang,2009）报道：不同类型的流感病毒对唾液酸受体的嗜性似乎不是严格与受体的类型相对应的。为了真正弄清楚流感病毒与唾液酸受体之间的关系，仍然需要更多的实验和分析。1.4流感唾液酸受体在抗流感研究中的应用以流感唾液酸受体为核心的新型药物的开发和防控措施的研究取得了较大的进展，人们在发现唾液酸受体与NA的相互作用后，利用唾液酸为母体化合物进行NA抑制剂作为抗流感药物研究已经取得了初步的成功，已上市的扎那米韦（zanamivir）和奥司米韦（oseltamivir）这两种新药就是基于流感唾液酸受体的研究来治疗流感的，且效果较好ADDINNE.Ref.{F1BB935E-5650-476A-ABE5-FA416FB1991E}（Kitazumeetal,2009;张杰等，2005），可以预言唾液酸衍生物必将成为开发抗流感病毒药物的热点。目前，人们用氟去置换唾液酸的第三个碳，希望开发出即可以和HA的结合又可以抑制了NA的水解的抗流感药物，希望该类唾液酸衍生物类的抗流感药物即可以阻止流感病毒的初期感染又可以抑制了流感病毒的后期释放ADDINNE.Ref.{29886E2A-74FF-4035-83B5-40E4E2141184}（郭潮潭等，2005）。流感唾液酸受体的嗜性和组织特异性，为流感细胞疫苗的制备提供了新的思路。人们已经开始利用基因重组的方法，制备富含特定类型流感受体的细胞进行流感病毒的增殖和疫苗的制备。曹文雁等ADDINNE.Ref.{D528B445-6EFC-466C-B1BA-8063F8523124}（曹文雁，2008）制备了稳定表达ST3GALI的MDCK细胞系，进而提高了细胞表面NeuAcα-2,3-Gal受体丰度，改进了流感病毒分离株在MDCK细胞系上的感染敏感性和复制能力。vanWielinkR等ADDINNE.Ref.{57ACE6FA-85D0-480F-B05D-7FE82EFAB03D}（vanWielinketal,2011）通过对MDCK细胞唾液酸受体表达状态的改良，使其可以进行流感病毒的悬浮培养，能培养出更多的流感病毒。相信在不久的将来，基于流感病毒唾液酸受体的基因工程细胞系将为大规模细胞培养流感疫苗生产提供了较好的工具。1.5流感唾液酸受体的研究展望作为流感受体的唾液酸很有可能成攻克流感的关键，近年来已成为流感研究领域的重要热点之一。流感唾液酸受体的研究刚刚处于起步阶段，还有很多方面的研究工作需要开展。人们迫切需要阐明的研究工作包括：（1）流感病毒的组织嗜性和唾液酸受体之间的关系；（2）流感唾液酸受体在流感病毒跨物种传播的作用；（3）唾液酸受体介导的流感病毒导致细胞变性、坏死的信号转导途径；（4）以流感唾液酸受体为核心的综合防控技术的研发；（5）以流感唾液酸受体为核心的糖组学对流感病毒入侵机制的影响。相信随着科学技术的进步，这些问题必将得到圆满的解决，人们会以流感唾液酸受体为突破口寻找到对抗流感这一世纪瘟疫的方法。2材料与方法2.1材料2.1.1实验动物试验所用三黄鸡购自华南农业大学，50日龄。2.1.2菌株和质粒菌株：感受态E.coliJM109，购自宝生物工程（大连）有限公司；感受态BL21(DE3)，购自北京鼎国生物技术有限公司产品。载体：pMD18-Tvector，购自宝生物工程（大连）有限公司。2.1.3主要试剂盒及试剂⑴TotalRNA抽提试剂购自宝生物工程（大连）有限公司Code:D312 RNAisoReagent100mL⑵PrimeScriptTM1STSTrandcDNASynthesisKit购自宝生物工程（大连）有限公司Code:D6110APrimeScriptRtase（200U/μL）50μL 5×PrimeScriptBuffer200μL RnaseInhibitor（40U/μL）25μL dNTPMixture（10mMeach）50μL OligodTPrimer（50μM）50μL Random6mers（50μM）100μL RnasefreeH2O1mL⑶TaKaRaExTaq购自宝生物工程（大连）有限公司Code:DRR001A TaKaRaExTaq(5U/uL)50uL 10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)1mL dNTPMixtrue(各2.5mM)800uL 6×LoadingBuffer1mL⑷pMD18-TVector购自宝生物工程（大连）有限公司Code:D101A pMD18-TVector(50ng/uL)20uL×1支 ControlInsert(50ng/uL)10uL×1支 LigationMix30uL×5支⑸DNA凝胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司Code:DV805 DR-IBuffer58mL DR-IIBuffer29mL RinseA28mL RinseB80mL ElutionBuffer5mL SpinColumn50支 CollectionTube50支⑹质粒DNA纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司Code:DV801 RNaseA1（50mg/mL）32μL SolutionI15mL SolutionII15mL SolutionIII24mL RinseA28mL RinseB80mL ElutionBuffer4mL SpinColumn50支 CollectionTube50支(7)SYBR®PremixExTaqTM(PerfectRealTime)200/次购自宝生物工程（大连）有限公司Code：DRR081A(8)DNAMarker2000购自宝生物工程（大连）有限公司Code：D501A(9)DNAMarker500购自宝生物工程（大连）有限公司Code：D525S(10)DEPC，溴化乙锭（EB），氨苄青霉素（Amp），卡那霉素（Kana），胰蛋白胨，酵母提取物等，购自北京鼎国生物技术有限公司产品。(11)DAB试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司Code：ZLI-9017(12)HIS标签单克隆抗体，购自广州展晨生物科技有限公司。(13)辣根酶标记山羊抗兔IgG，购自美国Jackson公司。(14)TMB底物显色试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司。(15)中性树胶(显微光学用)，购自上海标本模型厂产品。(16)苏木素，购自香港Fisherbrand公司。(17)IPTG购自宝生物工程（大连）有限公司。2.1.4主要溶液的配制RNA提取试剂的配制⑴0.1%DEPC水（v/v）：DEPC与去离子水按照0.1%的比例混合静置过夜，121℃高压灭菌20min。⑵75%乙醇无水乙醇750uL0.1%DEPC水250uL琼脂糖电泳用试剂的配制方法⑴溴化乙锭（EB）贮存液100mgEB溶于10mL去离子水，剧烈搅拌，完全溶解后，置于室温下避光保存。⑵50×TAE（Tris-乙酸） Tris24.2g冰乙酸57.1mL0.5MEDTA（pH8.0）10mL加去离子水，定容至100mL，使用前将其50倍稀释，即为工作液。大肠杆菌感受态转化用溶液的配制⑴氨苄青霉素(Amp)贮存液：取1g氨苄青霉素溶于10mL去离子水中，达到终浓度100mg/mL，并用0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。⑵IPTG(分子量238.3D)：异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，于8mL灭菌去离子水中溶2gIPTG，定容至10mL，0.22um微孔滤膜过滤，分装，-20℃储存备用。⑶X-gal：将20mgX-gal溶于1mL二甲基甲酰胺中，至终浓度为20mg/mL，分装，-20℃避光保存。⑷LB液体培养基胰蛋白胨10g酵母提取物5gNacl10g加去离子水950mL，用10MNaOH将pH调至7.4，定容至1L，121℃高压20min。⑸LB固体培养基在液体培养基的配方中，另加入细菌用琼脂糖15g，121℃高压20min。待冷却到50℃以下时，倒板。若需加入抗生素如氨苄青霉素（Amp)，卡那霉素（Kana）等，将培养基冷却至一定温度后再加入相应量工作浓度的抗生素，再倒制平板，4℃保存备用。⑹Amp/LB/X-gal/IPTG平板在制好的Amp/LB平板上加入40uLX-gal(20mg/mL)以及20uLIPTG(200mg/mL)，用已灭菌的涂抹棒均匀地涂布于平板表面。免疫组织化学相关溶液的配制⑴10%福尔马林固定液市场售甲醛（30%）100mL，称量Na2HPO4·12H2O39.5g，NaH2PO4·2H2O10.95g，双蒸水定容至1000mL。⑵0.02MPBS(pH7.2～7.6)1000mL双蒸水中加NaCl8.5g，Na2HPO42.8g，NaH2PO40.4g。⑶0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)1000mL双蒸水中加柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。2.1.5主要仪器设备液氮生物容器，型号YDS-20，购自四川亚西橡塑机器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，型号LDZX-50KBS，购自上海申安医疗器械厂；超速离心机，型号TGL-16H，购自珠海黑马医学仪器有限公司；冷冻台式离心机，型号TGL-16R，购自珠海黑马医学仪器有限公司；PCR扩增仪，型号PTC1148，产于美国BIO-RAD公司；可调式微量移液器：购自法国Gilson公司、芬兰大龙公司；水平电泳槽，型号DYY-6C型，产于北京市六一仪器厂；凝胶透射分析仪，型号UV-3B，购自珠海黑马医学仪器有限公司；Millipore超纯水器：购自密理博中国有限公司；Millipore超滤管：购自密理博中国有限公司；超低温冰箱，型号925，购自ThermoForma公司，产于美国；电热恒温鼓风干燥箱，型号101-1-BS，购自上海跃进医疗器械厂；紫外分光光度仪，型号UV/VISSpectrometerLambdaBio2.0，产于PE公司；单人单面净化工作台，型号SW-CJ-IFD，购自苏州净化设备有限公司；电子天平，型号JM2102，购自余姚纪铭称重校验设备有限公司；便携式pH计，型号PHB-3，购自上海三信仪表厂，中国上海；气浴恒温振荡器，型号SHZ-82，购自江苏金坛市宏华仪器厂，中国江苏；数显恒温水浴锅，型号HH-1，购自常州澳华仪器有限公司；研钵，钵棒，药匙，锡箔纸，各种耗材均购自广州丛源仪器有限公司；全自动脱水机，型号TP1020Leica，产于德国；烘片机，型号HI1220Leica，产于德国；轮转式切片机，型号RM2145Leica，产于德国；硅化玻片、盖玻片：购自盐城市恒泰玻璃仪器厂，产于中国江苏；光学显微镜，型号XSP-2C购自上海光学仪器五厂，产于中国上海；生物组织包埋机，型号BM-V购自孝感市电子仪器厂，产于中国孝感；电热恒温水浴锅，型号KWS购自宁波自动化仪表厂，产于中国浙江；电热恒温鼓风干燥箱，型号101-1-BS购自上海跃进医疗器械厂，产于中国上海；显微照相设备，型号Axioskop2plusZEISS，产于德国；2.1.6分析工具软件所用同源性分析软件：NCBI，GENETYX-MAC8.5，DNAMAN；所用PCR引物设计软件：Primer5.1；所用DNA序列数据库：NCBI/Genbank/nucleotide。所用统计学分析软件：SPSS18.0。2.2方法2.2.1鸡ST基因的克隆三黄鸡肝脏总RNA的提取试验用品预处理：研钵，钵棒，药匙等0.1%DEPC水洗净后，锡箔纸包裹，200℃烘烤6小时；一次性塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡过夜后用牛皮纸包裹，高温高压后，37℃烘干后备用。实验所用提取步骤参照TrizolReagent的操作说明书进行：⑴将已速冻的三黄鸡组织迅速转移至已液氮预冷的研钵中，用钵棒迅速研磨组织，期间不断加入液氮保持低温环境，直至研磨成粉末状。取约150mg组织粉末加入到1mL预冷的RNAisoReagent离心管中，迅速摇晃，室温静置5min。⑵加入200μl氯仿，震荡待溶液呈乳白状后，室温静置5min，4℃12,000×g离心15min。⑶从离心机中小心取出离心管，此时可见液体分为上中下三层，即：无色的上清层，中间的白色蛋白层和带有颜色的下层有机相。将上清夜(约0.5mL)转移到新的离心管中。(4)向上清中加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒离心管，混匀后，室温静置10min。4℃，12000g离心10min。离心后，离心管底部将出现沉淀。(5)小心弃去上清，缓慢加入75%的乙醇1mL用于洗涤RNA沉淀；4℃12,000g离心5min；小心弃去乙醇。(6)室温干燥沉淀2-5分钟后，加适量的DEPC水溶解RNA；分别取出1μL测定浓度和纯度，其余RNA保存于-80℃。引物的设计与合成参照GenBank原鸡ST基因设计特异性引物,用以扩增三黄鸡ST基因，引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成，详情见表1。基因基因登录号上游(F1)下游(R1)TmST3GalINM_2052175'-CCCACGTCGTGCTCCACCAG-3'5'-GCAGCCCCTGCTTGTCCCTG-3'61ST3GalIIIXM_0012335055'-ATGGGACTGCTGGTGTTCATGC-3'5'-CAGTGCCTGCTCCCAGAGCC-3'58ST3GalIVXM_4178605'-CTCGGCTGATGCCTGCCCTG-3'5'-CCACTGCGGGCTCCAAGGTG-3'61ST3GalVNM_0010011925'-AGCTGCACATGAAGATGAGAAGACC-3'5'-AATCCAGGCCGTGCTGCACT-3'56ST3GalVINM_2044795'-CGGACGGTACGGCCCCTCTA-3'5'-TCCATCCAGCTTTCACGTCAAGTTG-3'58ST6GalINM_2052415'-CCCGTGCTCACTGTCCCGTTTG-3'5'-CTGCAACGCGGAAGAGCCGTC-3'61ST6GalIINM_0011677475'-ATGAAACCTAACTTGAAGCAATGGA-3'5'-CGGCCTAAGTATGTCCTCTGCA-3'54表1.ST基因引物表cDNA的合成⑴按照PrimeScriptTM1STSTrandcDNASynthesisKit的使用说明书，在0.2mLPCR管中加入下列试剂：TotalRNA(1µg/µL)2µLOlidodTPrimer1µL10mMdNTPMixtureDEPC水Total1µL6µL10µL⑵在PCR仪上进行变性，退火反应： 65℃5min 冰上急冷⑶在上述PCR管中加入下列反转录反应液：上述变性，退火后反应液10µL5×PrimerScriptBuffer4µLRNaseInhibitor0.5µLPrimeScriptRtaseDEPC水Total1µL4.5µL20µL⑷在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应： 42℃60min 70℃15min 50℃1min End⑸取1uLcDNA测定浓度，取适量cDNA进行PCR扩增，其余分装后于-20℃保存备用。PCR扩增三黄鸡ST基因根据TaKaRa提供的引物合成说明书，将引物稀释至终浓度20pmol/uL。稀释过程中要小心操作，以避免引物粉末飞出，影响终浓度。根据TaKaRaExTaq说明书确定PCR反应体系。PCR反应体系如下：10×ExTaqBuffer2.5µLdNTPMixture2µLF11µLR1cDNA1µL2.5µLTaKaRaExTaq0.2µL灭菌双蒸水Total15.8µL25µLPCR反应条件： 94℃5min 94℃30s Tm℃40s35moretimes 72℃90s 72℃10min End琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增结果。PCR产物的回收依据DNA凝胶回收试剂盒的使用说明，纯化并回收目的片段，步骤如下：⑴从琼脂糖凝胶上切下目的DNA片段，置于1.5mLEp管中，称量凝胶重量并计算凝胶体积（以1mg=1μL的比例进行计算）。⑵加入4倍体积的DR-IBuffer，65℃水浴6～10min，并于其间轻摇几次让胶块完全熔化。⑶向上述EP管中加入DR-IBuffer1/2体积量的DR-IIBuffer，颠倒几次使其混合均匀。⑷将SpinColumn安置于CollectionTube上，将溶液倒入SpinColumn内，室温12000rpm离心1min，弃滤液。⑸500μL的RinseA加入SpinColumn，室温12000rpm离心30s，弃滤液。⑹700μL的RinseB加入SpinColumn，室温12000rpm离心30s，弃滤液。⑺重复步骤⑹。⑻将SpinColumn置于新的EP管内，用30μL去离子水洗脱DNA，12000rpm离心1min，回收离心液。取1μL电泳用于检查回收结果。感受态细胞（JM109）的制备（氯化钙法）⑴取-80℃保存的菌种，吸取40μl在琼脂平板上复苏，37℃过夜。⑵挑取单菌落划线，37℃培养过夜。⑶在一个灭菌的试管中加入2-3mL灭菌的LB培养基，用灭菌的牙签挑取平板上的单菌落，接种到LB液体培养基中，于37℃摇床培养过夜。⑷取前一天摇的菌液100μl于新的灭菌10mLLB中，放到37℃摇床上，约2h，直至云雾状。⑸将100mL菌液分装于2个50mL的灭菌离心管中，冰上静置3min，4℃7000prm离心10min，弃上清。⑹每管加3mL预冷的0.1mol/LCaCl2轻轻吸打悬浮菌体，然后两管并为一管，4℃7000rpm离心，10min，弃上清。加1mL预冷的CaCl2用于悬浮菌体，然后加15%甘油，按100μl每管分装于1.5mLEp管中，-80℃保存备用。pMD18-T载体的连接反应pMD18-TVector（50ng/µL）aµLPCR回收产物bµL灭菌双蒸水cµLLigationMix5µLTotal10µL在0.2mLPCR管中加入下列溶液，全量为10uL：(载体和回收产物的摩尔质量比为1:3)混匀后，将连接体系置于4°C水浴过夜，准备用于转化。连接产物的转化⑴将50-100μL感受态置于冰上融化，溶化后中加5-10μLPCR连接产物，混匀，冰上静置30min。⑵轻轻将混合物置于42℃水浴热激45-60s，然后迅速移至冰上预冷2min。⑶加入390uL灭菌LB液体培养基，于37℃，250rpm，摇床培养45-60min。⑷将液混匀涂布于Amp/LB/X-gal/IPTG平板上，待菌液被平板吸收后，将平板放在37℃温箱中倒置培养过夜。阳性质粒的鉴定菌落PCR鉴定:10×ExTaqBuffer2.5µLdNTPMixture2µLF11µLR11µLTaKaRaExTaq0.2µL灭菌双蒸水18.3µLTotal25µL分别用灭菌牙签挑选若干白斑，在反应体系中捻动数次，弃掉牙签，盖好PCR管盖，短暂离心后放入PCR仪。PCR反应条件： 94℃5min 94℃30s Tm℃40s30moretimes 72℃150s 72℃10min End取上述PCR产物进行电泳，选出阳性菌落。质粒的提取