动物分子生物实验：实验二 哺乳动物白细胞DNA分离

实验二哺乳动物白细胞DNA分离一、实验目的掌握利用苯酚抽提法提取DNA的技术；明确影响提取畜禽血液DNA质量的因素。（1）DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。核酸的理化性质（2）在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。二、实验原理天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。环绕着8个组蛋白构成核小体从细胞中提取DNA时，要先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。

DNA提取的几种方法

利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中，离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇，立即用搅拌法搅出。然后分别用66%、80%和95%乙醇以及丙铜洗涤，最后在空气中干燥，既得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不用。为除蛋白可将此法加以改良，在提取过程中加入SDS。（1）水抽提法

（2）阴离子去污剂法用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，因为阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。（3）浓盐法

利用DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯化纳抽提，得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡，使乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中，氯仿位于下层，用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用，在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用0.15MNaCl，0.015M柠檬钠，并称SSC溶液，提取DNA。（4）苯酚抽提法

苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃棒漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。三、主要仪器及试材实验器材：高速冷冻离心机，高压灭菌锅，离心管，枪头，移液器，恒温水浴摇床，冰箱等试剂及作用

SDS（十二烷基硫酸钠）：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，使细胞膜裂解，并解离细胞中的核蛋白，使与DNA双链紧密结合的组蛋白分开和变性，破坏蛋白质的二级和三级结构，使其容易被蛋白酶水解。另外，还能与蛋白质结合而沉淀。EDTA（乙二胺四乙酸）：可以螯合Mg离子，从而有助于阻止核酸分子间的聚集及核酸与蛋白质间的聚集，与SDS一样还可抑制核酸酶的活性。蛋白酶K：能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，在SDS存在下活性增强，不受EDTA的抑制，在较高温度下仍有活性。苯酚/氯仿：除去变性的蛋白质及多糖、脂类等杂质，氯仿还可除去水相中残留的酚。异戊醇：防止水相和有机相之间的蛋白质起泡。酚：市售的酚需要重新蒸馏，在酚中加入0.1%的抗氧化剂8－羟基喹啉，可减缓酚的氧化，还可使试剂变成黄色。酚试剂PH值应调到8.0（PH5-6，DNA可以部分地溶解在有机相或界面中，在更酸的条件下DNA发生脱嘌呤而产生缺口）。四、实验方法与步骤白细胞沉淀加入1×SET1~2ml，蛋白酶K30μl左右至终浓度100μg/ml，10％SDS150μl至终浓度0.5%，55℃水浴消化过夜加入等体积的Tris.Cl饱和酚，轻轻摇匀10-20min，10000g离心10min

转移上层水相至另一离心管中（重复此步骤一次）加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），轻轻摇动10-20min以混匀

10000g离心10min，吸取上层水相于另一离心管

加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）轻轻摇动10min以混匀，10000g离心10min，吸取上层水相于另一离心管加入两倍体积冰预冷无水乙醇，轻轻转动离心管，DNA呈絮状析出

10000g离心5min沉淀DNA或用玻棒或去头吸管小心挑出DNA沉淀，放入1.5ml离心管中加入200μl去离子水溶解DNA，分装保存

再用预冷无水乙醇漂洗一次，10000g离心5min沉淀DNA，弃乙醇，自然干燥DNA沉淀五、实验注意事项

混匀时力度不应过大；吸取上层水相时，应小心吸取，不应吸取蛋白质层；