基因工程操作演示文稿

基因工程操作演示文稿1目前一页\总数一百一十六页\编于十六点2优选基因工程操作目前二页\总数一百一十六页\编于十六点供体+载体重组体受体工程细胞分子水平细胞水平

分切连

转筛表

基因工程的四类技术：提取，重组，转移，表达基因工程的三个要素：供体，载体，受体目前三页\总数一百一十六页\编于十六点一、分离：提取、制备目的基因和载体DNA（一）目的基因概论

1.目的基因的定义：目的基因指基因工程要克隆和表达的靶基因，要获得该基因产物的目标基因。因为多来自另一不同生物基因组，故称外源目的基因。

2.目的基因要求：

必须获得高纯度、足数量、质完整的目的基因，才能克隆、扩增和表达出目的基因产物。

目前四页\总数一百一十六页\编于十六点3.目的基因的用途：理论上①研究基因结构、功能及调控；②研究生物进化及相关同源性；③与正常基因比较，查出异常，确定疾病基因。

应用上①基因工程大量表达目的蛋白质，多肽和酶；②为基因治疗，基因预防提供正常目的基因；③在农、林、牧、渔业中，改进良种等。

目前五页\总数一百一十六页\编于十六点从生物基因组中分离目的基因

原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。从mRNA获得目的基因从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因，也可通过cDNA文库的方法获得目的基因。其他方法（见后）4.目的基因的获得：目前六页\总数一百一十六页\编于十六点（二）构建DNA文库基因组文库（genomiclibrary）

（含有全部基因）cDNA文库（complementaryDNAlibrary）（含有全部蛋白质编码的结构基因）目前七页\总数一百一十六页\编于十六点

基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。1.基因组文库的构建目前八页\总数一百一十六页\编于十六点

提取基因组DNA，采用限制酶将基因组DNA切割成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都转化宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的集合体，这样一个集合体称为基因组文库。这种保存了该种生物所有遗传信息文本，就如图书馆，用时随时抽取。通过杂交筛选获得特定的基因片段。目前九页\总数一百一十六页\编于十六点

细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建

细胞内总DNA的提取分离程序目前十页\总数一百一十六页\编于十六点基因文库的构建图目前十一页\总数一百一十六页\编于十六点

理想的基因组文库中

所有克隆DNA片段的总和应为整个基因组的DNA序列。克隆与克隆之间应有重叠序列。

目前十二页\总数一百一十六页\编于十六点

个体的所有细胞均具有相同的基因组结构，但在同一机体不同类型的细胞或同一细胞在生长发育的不同阶段，以及受到不同因素（物理、化学或生物因素）的刺激，基因表达的种类与数量是不同的。2.cDNA文库的构建目前十三页\总数一百一十六页\编于十六点

cDNA文库是某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克隆。只有在细胞内存在mRNA，才能建成相应的cDNA文库，所以不同种类及不同状态的细胞有不同的cDNA文库。目前十四页\总数一百一十六页\编于十六点构建cDNA文库前，必须先从细胞中提取高质量的mRNA。因mRNA有poly（A）尾巴，可用12～18寡聚d（T）片段作为引物，加入4种dNTP，AMV（或MMLV）逆转录酶催化第一股链的合成。目前十五页\总数一百一十六页\编于十六点用RNaseH去掉mRNA，剩下的单链DNA的3′端往往有自发回折（原因不明）形成的发夹结构，正好可以作为合成第二条DNA链的引物。由T4DNA聚合酶催化第二股链的合成，即得到双链cDNA的混合体。采用SI核酸酶处理，可得到平端的双链cDNA，然后再与载体进行连接。目前十六页\总数一百一十六页\编于十六点将cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA。将得到的所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的集合体，这样一个集合体就称为cDNA文库（cDNAlibrary）。完成DNA重组后可通过杂交筛选获得特定的cDNA克隆。目前十七页\总数一百一十六页\编于十六点cDNA克隆的制作过程目前十八页\总数一百一十六页\编于十六点基因组DNA文库和cDNA文库的构建目前十九页\总数一百一十六页\编于十六点

（三）制备目的基因的方法

1.从文库中提取

在已建立的基因组文库、cDNA文库中取得目的基因的克隆，提取DNA，经限制酶切下，插入到相关载体。

目前二十页\总数一百一十六页\编于十六点

用分子杂交的方法从基因文库中钓取目的基因目前二十一页\总数一百一十六页\编于十六点

（2）从基因组DNA直接切取

对一些相对小的基因组，其物理图谱已经确定，背景资料清楚的原核生物、病毒等基因组，可直接用限制酶消化后，电泳分离获得目的基因片段。可以从其它已克隆的质粒上用限制酶切下，再插入到有关载体上。目前二十二页\总数一百一十六页\编于十六点（3）用PCR技术体外扩增有关DNA片段

用PCR技术可以在体外有效而且特异地扩增目的基因片段。在已知序列的前提下，可以采用RT-PCR方法直接从mRNA获得特定基因的cDNA。也可从已有的cDNA克隆中扩增出编码区的DNA片段，用于构建表达载体。因为PCR有一定错配率，必须用测序予以确认。目前二十三页\总数一百一十六页\编于十六点

（4）化学合成

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列应用：一般用于小分子肽类基因的合成使用DNA合成仪合成的片段长度有限，较长的链则须分段合成，然后用连接酶进行连接。目前二十四页\总数一百一十六页\编于十六点（四）载体的选择和制备λ噬菌体和粘性质粒适用构建基因组文库。pUC系列等质粒适合构建cDNA文库和克隆一些较小的DNA片段。M13噬菌体则用于克隆一些待测序的DNA片段。目前二十五页\总数一百一十六页\编于十六点

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。目前二十六页\总数一百一十六页\编于十六点

无论选用何种载体，首先都要获得载体分子，即分离纯化λ噬菌体DNA或制备粘性质粒和其它有关质粒。获得载体后，采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得线性分子，以便于与目的基因片段进行连接。目前二十七页\总数一百一十六页\编于十六点二、酶切

获得目的基因和载体DNA之后，为了进行重组，必须对它们进行酶切或加上接头，在线性状态下，为连接作好准备，应注意工具酶的选择保证连接成功。目前二十八页\总数一百一十六页\编于十六点

三、连接

不同来源的DNA片段通过限制酶切断或机械力剪切后，可以在体外重新连接起来，形成人工重组体。体外连接的方法主要有以下四种。目前二十九页\总数一百一十六页\编于十六点

1.粘性末端连接

大多数限制酶错位切断DNA分子，产生5′或3′粘性末端，如果用同一种酶消化载体和目的DNA分子，或者载体DNA和目的DNA虽然用不同的酶处理，但能产生相同的粘性末端，那么DNA片段之间很容易按照碱基配对关系退火，互补的碱基以氢键相结合。在T4DNA连接酶的作用下，其末端以磷酸二酯键相连接，成为环状DNA重组体。目前三十页\总数一百一十六页\编于十六点

由于载体DNA经一种限制酶切割后，其两端的碱基序列互补，因而线性的载体DNA可以自身环化，形成空白载体，使DNA重组体的比例下降，为目的基因的筛选带来困难。避免方法之一是将载体DNA在限制酶切割之后，用碱性磷酸酶处理，除去5′磷酸基团。这样载体DNA不能自身环化，只能与未经碱性磷酸酶处理的外源DNA片段连接。目前三十一页\总数一百一十六页\编于十六点目前三十二页\总数一百一十六页\编于十六点2.利用人工接头（linker）连接

某些限制酶如HaeⅢ、SmaⅠ等切割DNA可产生平末端，机械力剪切的DNA以及cDNA等也是平端，这种情况采用人工合成的接头进行连接比较有效。接头指含有某些限制酶切点的寡核苷酸片段，在T4DNA连接酶的作用下，将接头连接到目的DNA片段的两端，然后再用相应的限制酶切割，这样外源DNA片段的两端具有了粘性末端，可以连接到用同一限制酶线性化了的载体上去。目前三十三页\总数一百一十六页\编于十六点人工接头(linker)连接CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ目前三十四页\总数一百一十六页\编于十六点

3.加入同聚体尾连接

将目的DNA片段用λ外切核酸酶作有限消化或者用能产生3′粘性末端的限制酶（如PstⅠ）消化，生成具有3′-OH的单链末端。暴露出来的3′-OH末端是末端转移酶的良好底物，该酶可将某种单一脱氧核苷酸逐一加到3′-OH上去，生成某一脱氧核苷酸的同聚体尾。目前三十五页\总数一百一十六页\编于十六点载体质粒用能产生3′粘性末端的限制酶消化生成3′粘性末端，在反应体系中加入互补的单一脱氧核苷酸，在末端转移酶的作用下产生与目的基因末端同聚体尾互补的同聚体尾，将目的DNA片段与载体混合，两种DNA分子通过互补的同聚体尾形成氢链，末端间的空隙在导入宿主菌后，可在细菌体内有关酶的作用下自行修复。目前三十六页\总数一百一十六页\编于十六点同聚物加尾连接T(T)nT3´3´T(T)nTA(A)nA3´T(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶重组体5´3´3´5´载体DNA限制酶5´3´3´5´λ-核酸外切酶末端转移酶+dTTP5´5´5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切5´

3´3´5´λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP5´5´3´

A(A)nA目前三十七页\总数一百一十六页\编于十六点

（4）平端连接

不同方式产生的平端DNA片段可以在T4DNA连接酶的作用下，与某些限制酶产生的平端载体相连接。为提高连接效率，在连接这样的DNA片段时，所用的ATP及T4DNA连接酶的浓度比粘性末端要高些。目前三十八页\总数一百一十六页\编于十六点

（5）T-A克隆

T-A克隆是一种对PCR产物直接克隆的技术。PCR反应，扩增的目的DNA产物两端被TaqDNA聚合酶加两个A，这不依赖模板。把载体断口人工加两个T，测产物和载体可以连接。目前三十九页\总数一百一十六页\编于十六点T-A克隆T-vector两条链的5’端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A目前四十页\总数一百一十六页\编于十六点（6）定向克隆(directlycloning)

把外源目的基因定向插入到载体分子中的克隆方案叫定向克隆。定向克隆在构造表达载体系统时很重要，保证方向正确，才能正确表达。定向克隆有两种连接方式：①用两个不同粘性末端的酶切割目的基因和载体DNA，产生非同源粘末端，保证定向，粘-粘连接。②用一侧平端，一侧为粘性末端，粘-平连接，保证方向正确。目前四十一页\总数一百一十六页\编于十六点EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶重组体定向克隆可有效避免载体自连和DNA片段的反向插入目前四十二页\总数一百一十六页\编于十六点四、转移：将重组DNA导入宿主细胞

常用的方法有：

转化（transformation）

质粒或黏粒→细菌（感受态细胞，competentcell）质粒→酵母菌（真核细胞）转染（transfection）外源DNA→真核细胞（酵母除外）噬菌体DNA→感受态细菌感染（infection）噬菌体颗粒→细菌病毒颗粒→哺乳细胞目前四十三页\总数一百一十六页\编于十六点（一）转化（transformation）

指将质粒或其它外源DNA导入处于感受状态的宿主细菌/细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。转化的方法很多，常用的是氯化钙法、电穿孔法等。目前四十四页\总数一百一十六页\编于十六点

1.

氯化钙转化法：

在最适条件下培养大肠杆菌到对数生长期，收获大肠杆菌并悬浮在CaCl2（50mmol/L）溶液中，置于低温（0～5℃）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力，这种细胞称为感受态细胞（competentcell）。

感受态细胞可以悬浮于50%甘油中，-80℃保存6个月而不丧失活性。

目前四十五页\总数一百一十六页\编于十六点

在感受态细胞悬液中加入质粒DNA（重组的或非重组的），使其进入细胞内。冰浴1小时后，立即转移至42℃热休克90秒后，促进受体细胞吸收DNA，马上转移到37℃水浴，并加入不含抗生素的培养基37℃振摇培养30～60分钟，使质粒DNA得到复制，并使抗生素的抗性基因得以表达。随后，再将转化的细菌接种在含有抗生素的琼脂平板上，过夜生长，从而得到转化的菌落。目前四十六页\总数一百一十六页\编于十六点

在合适条件下，细菌约每20分钟分裂一次，十个小时，琼脂平板上便出现肉眼可见的菌落。每个菌落都是单一细菌的后代，所有细菌都具有相同的遗传组成，称为细菌的克隆（clone）。在一个克隆中，所有的细菌含有相同的外源DNA插入片段，如将这样的一个菌落培养，生长出的菌落均含有相同的外源DNA序列，这一过程便是克隆化。应用这一方法，可使某一特殊的重组DNA片段扩增至数百万个拷贝。目前四十七页\总数一百一十六页\编于十六点

粘粒带有一个复制起点和一个药物抗性标志，粘性质粒也能由标准的转化方法导入大肠杆菌，并像普通质粒一样增殖。目前四十八页\总数一百一十六页\编于十六点

2.电穿孔法（electroporation）

也是一种将外源DNA导入大肠杆菌细胞的常用方法之一。将外源DNA与大肠杆菌混合于电穿孔杯中，在高频电流的作用下，细胞壁出现许多小孔，使外源DNA能进入大肠杆菌细胞，无需制备感受态细胞。目前四十九页\总数一百一十六页\编于十六点电击法目前五十页\总数一百一十六页\编于十六点（二）感染（infection）

以λ噬菌体、粘粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，能主动感染适当的细胞，并在细胞内扩增。目前五十一页\总数一百一十六页\编于十六点

为使λDNA重组体能够感染大肠杆菌，必须在体外将λDNA重组体与λ头部及尾部蛋白混合，使λDNA重组体被包入头部蛋白外壳中，使之成为完整的噬菌体，才具有感染力。目前五十二页\总数一百一十六页\编于十六点

粘粒含有λDNA的cos区，也可用包装λDNA相同的方法，体外包装成λ噬菌体，再感染大肠杆菌。感染效率远远高于转化效率。粘粒也可经由转化程序，将DNA导入宿主细胞，但其转化效率非常低。目前五十三页\总数一百一十六页\编于十六点

（三）转染（transfection）

由转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。目前五十四页\总数一百一十六页\编于十六点

（四）转移重组体过程中的几个问题

含目的基因的重组体能否有效地导入受体细胞，取决于是否选用合适的受体细胞、克隆载体和基因转移方法。目前五十五页\总数一百一十六页\编于十六点1．受体细胞克隆的受体细胞

从实验技术上讲是能摄取外源DNA(基因)并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。目前五十六页\总数一百一十六页\编于十六点

原核生物细胞是一类很好的受体细胞，容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作。可用作cDNA文库和基因组文库的受体菌，用作建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主。目前用作基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌，蓝藻和农杆菌等也被广泛应用。原核生物细胞受体细胞目前五十七页\总数一百一十六页\编于十六点

真核生物细胞受体细胞

酵母、某些动、植物的细胞。由于酵母的某些性状类似原核生物，所以较早就被用作基因克隆受体。目前五十八页\总数一百一十六页\编于十六点

动物细胞也已被用作受体细胞采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为基因转移的受体细胞，由此培养成转基因动物。体细胞可表达基因产物，并且最近通过体细胞培养出了多种克隆动物，可见动物体细胞同样可以用作基因克隆的受体细胞。1）动物细胞受体细胞目前五十九页\总数一百一十六页\编于十六点2）植物细胞受体细胞

优于动物细胞的特点，一个活的离体体细胞在合适的培养条件下比较容易再分化成植株，意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养成能传代的植株，成为转基因植物。由于这个原因，近年来植物基因工程发展非常迅速。目前六十页\总数一百一十六页\编于十六点

2．重组DNA分子导入原核生物细胞

大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体细胞，可以通过转化、转导和三亲本杂交等途径，把重组DNA分子导入受体细胞。目前六十一页\总数一百一十六页\编于十六点（1）转化途径（2）转导/感染途径（3）重组DNA分子通过三亲本杂交转化大肠杆菌。目前六十二页\总数一百一十六页\编于十六点

当重组DNA分子不能直接转化受体菌时，可采用三亲本杂交（triparentalmating）转化法。被转化的受体菌、含重组DNA分子的供体菌和含广泛宿主辅助质粒的辅助菌三者进行共培养，在辅助质粒的作用下，重组DNA分子被转移到受体菌细胞内，按照重组DNA分子携带的选择标记筛选克隆子。目前六十三页\总数一百一十六页\编于十六点3．重组DNA分子导入真核生物细胞

真核生物的细胞结构较为复杂，适用于原核生物基因转移的方法不能有效地用于真核生物。因此，近年来经过探索，发展了多种适用于植物和动物转基因的方法。目前六十四页\总数一百一十六页\编于十六点（1）重组DNA分子导入植物细胞用致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法

含Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物细胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可导入植物细胞，整合到植物基因DNA，随其复制而复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体，与含目的基因的DNA片段重组，导入致癌农杆菌，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。目前六十五页\总数一百一十六页\编于十六点其方法有：①叶盘转化法：

将致癌农杆菌接种在植物新产生的伤口，可获得转基因植株。②原生质体共培养转化法：

含Ti重组质粒DNA致癌农杆菌，同植物原生质体进行共培养，使重组DNA导入细胞，经培养获得转基因植株。③

悬浮细胞共培养转化法：目前六十六页\总数一百一十六页\编于十六点

重组DNA的直接转移法

为克服致癌农杆菌介导法的受体局限性，近来发展了电穿孔法、微弹轰击法、激光微束穿孔法、多聚物介导法和花粉管道法等，把重组DNA分子直接导入植物细胞。采用的克隆载体不限于Ti质粒载体。目前六十七页\总数一百一十六页\编于十六点

3.重组DNA分子导入哺乳动物细胞

哺乳动物的细胞不易从周围捕获外源DNA，明显地影响了哺乳动物转基因的发展。近年来通过研究发展了一系列能有效地将外源DNA分子导入哺乳动物细胞的方法，主要有以下几种：目前六十八页\总数一百一十六页\编于十六点

①病毒颗粒转导法

由于病毒的种类繁多，用病毒DNA或RNA构建的载体性质各异，所以转导的过程各有不同。

主要有三种类型：其一，带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上；目前六十九页\总数一百一十六页\编于十六点

其二，带有目的基因的病毒基因组是缺陷型的，需同另一辅助病毒一起感染受体细胞；其三，虽然带有目的基因的病毒基因组是缺陷型的，但是被感染的受体细胞的基因组中已整合了病毒缺失的基因，所以没有必要用辅助病毒混合感染。目前七十页\总数一百一十六页\编于十六点

②用磷酸钙转染法

哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。先将待转染的重组DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，随后逐滴缓慢地加入Hepers-磷酸钙溶液中，形成DNA-磷酸钙沉淀，粘附在培养的细胞表面上，达到转染目的。目前七十一页\总数一百一十六页\编于十六点

③DEAE-葡聚糖转染法

DEAE-dextran(二乙胺乙基葡聚糖)是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA分子。基本操作：其一，先使病毒的DNA直接同DEAE-葡聚糖混合，形成DNA-DEAE-葡聚糖复合物，再处理受体细胞；其二，受体细胞先用DEAE-葡聚糖溶液预处理，随后再同DNA接触，也可达到转染目的。目前七十二页\总数一百一十六页\编于十六点

④聚阳离子-DMSO(二甲基亚砜)

处理转染法

用聚阳离子(polybrene)处理哺乳动物细胞，使细胞表面增加对外源DNA的吸附能力，再用25％～30％DMSO处理细胞，增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量，达到有效的转染。目前七十三页\总数一百一十六页\编于十六点

⑤脂质体介导法

脂质体(1iposome)是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，把用来转染的DNA分子包在其中，通过脂质体与细胞接触，将外源DNA导入受体细胞。目前七十四页\总数一百一十六页\编于十六点

包装成脂质体的SV40-DNA的转染率比裸露的DNA的转染率高出100倍。如先用PEG处理培养的受体细胞，使其易吸收培养基中的脂质体，可提高转染率10～20倍。在正常情况下，每个细胞平均可吸收1000个左右的脂质体。这是哺乳动物转基因研究中常用的方法之一。目前七十五页\总数一百一十六页\编于十六点

⑥显微注射转基因技术

鉴于哺乳动物细胞便于注射的特性，常应用显微注射法把外源DNA分子直接注入细胞。获得稳定转化子的数量取决于注射的DNA分子。用pBR322/HSV-1tk重组DNA分子注射，转化率不到0.1％，而用连接SV40-DNA某些序列的pBR322／HSV-1tk重组DNA注射，转化率可高达20％。目前七十六页\总数一百一十六页\编于十六点

为便于操作，也可采用“穿刺”法。处于细胞周围的DNA随微针穿刺形成的小孔进入细胞，或随穿刺的针头带入细胞。⑦电穿孔法

其原理和操作过程类似植物细胞的电穿孔转移DNA的方法。目前七十七页\总数一百一十六页\编于十六点五、筛选：

对工程菌/工程细胞进行筛选和鉴定筛选的目的①找到含目的基因克隆的菌落；②确定重组体的正确性。目前七十八页\总数一百一十六页\编于十六点

将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务就是要筛选含有目的基因的转化菌并加以扩增。其步骤是：首先筛选出转化菌；然后筛选出带有重组体的克隆；最后是对DNA重组体进行鉴定。目前七十九页\总数一百一十六页\编于十六点

鉴定的方法有多种：

①用克隆工具酶切，比较分析

②PCR扩增

③必要时进行DNA序列分析，以确定其大小，插入方向和碱基构成正确。

所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。

目前八十页\总数一百一十六页\编于十六点（一）遗传学方法1．筛选转化菌遗传学选择是鉴定一个数目庞大的细胞群体最为有效的方法，所有的克隆载体均带有可供选择的遗传学标志或特征，为遗传学选择带来了方便。质粒中含有针对某种抗生素的抗性基因，转化后，将细菌在含有这种抗生素的培养基中培养，未被转化的细菌即被杀死，能生长的细菌就是已转化的细菌。本法又称抗生素抗性转入获得法。目前八十一页\总数一百一十六页\编于十六点

2．筛选带有重组体的克隆

（1）插入灭活法（insertioninactivation）：

常被用于鉴别质粒重组体和非重组体，适用于具有两个或两个以上抗生素抗性标记的质粒。例如pBR322中有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr），Tetr上有一个BamHⅠ位点，如将外源DNA通过BamHⅠ位点插入到Tetr基因的DNA序列中，使Tetr基因灭活。目前八十二页\总数一百一十六页\编于十六点pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板目前八十三页\总数一百一十六页\编于十六点MCS有插入片段MCS无插入片段β-半乳糖苷酶X-Gal蓝色LacZ基因MCS载体上有β-半乳糖苷酶N端编码序列，细菌染色体DNA有β-半乳糖苷酶C端编码序列（2）α-互补：“蓝-白筛选”目前八十四页\总数一百一十六页\编于十六点（二）免疫学方法（目的基因产物检测）

如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可以用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光、显色反应进行或免疫印迹试验筛选。目前八十五页\总数一百一十六页\编于十六点（三）核酸杂交法

对噬菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。目前八十六页\总数一百一十六页\编于十六点32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法DNA杂交直接鉴定目前八十七页\总数一百一十六页\编于十六点（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析转化子的分析—Southern杂交目前八十八页\总数一百一十六页\编于十六点

（四）PCR技术

PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，PCR技术对于鉴定阳性克隆十分有效，而且无须制备DNA。

PCR获得目的片段可以通过分子杂交和DNA测序进一步鉴定。目前八十九页\总数一百一十六页\编于十六点（五）酶切鉴定

在转化大肠杆菌并获得了一系列菌落后，可用牙签挑出单个菌落接种于2ml培养基中，37℃过夜生长。用小量快速提取质粒DNA，选用1～2个限制酶分析，电泳后观察有无插入片段、插入方向及与设计目的基因大小一致。这是最简单的“筛克隆”鉴定方法。目前九十页\总数一百一十六页\编于十六点（六）表达动物生物活性鉴定

依据目的基因产物的生物活性进行设计。提取、纯化表达产物后，可选用依赖细胞株培养（如细胞因子IL-2等），对底物催化活性（酶）等进行最后鉴定。目前九十一页\总数一百一十六页\编于十六点

（七）DNA测序法

检测目的基因有无发生突变并作鉴定。

（八）目的基因转录产物检测

检测目的基因在受体细胞中是否进行转录，提取总RNA，用杂交或RNA印迹法检测。目前九十二页\总数一百一十六页\编于十六点

六、表达表达产物与下列因素有关：目的基因的特点，理化性质和应用要求表达载体的启动子、终止子和核糖体结合位点的强弱基因拷贝数及在细胞中的状态宿主细胞的稳定性、翻译效率表达的外源蛋白自身的稳定性目的基因的表达是基因工程的最后一步，也是基因工程的目的。目前九十三页\总数一百一十六页\编于十六点（一）原核细胞表达体系主要利用细菌

表达外源蛋白原核表达体系主要以细菌作为宿主细胞，包括大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、沙门氏菌、苏云金杆菌等，其中又以大肠杆菌表达体系应用最为广泛和最成熟。原核表达体系既可用于原核基因表达，也可用于真核基因表达。目前九十四页\总数一百一十六页\编于十六点

大肠杆菌(Escherichiacoli)

遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高。不具备真核细胞的蛋白质复性系统，真核基因在大肠杆菌中会合成错误空间构象的多肽链，易形成包涵体(无正确折叠的立体结构)无真核生物的蛋白质加工系统，如糖基化磷酸化修饰等目前九十五页\总数一百一十六页\编于十六点（1）将外源基因置于强启动子和SD顺序（核糖体结合位点）控制下；（2）删除内含子和5′非编码区；（3）维持正确开放阅读框架（ORF）；（4）mRNA稳定且可被有效翻译和折叠，形成的蛋白质不被降解。

外源基因在原核表达体系中表达的必要条件：正常的转录与翻译目前九十六页\总数一百一十六页\编于十六点原核表达体系有以下优势：①宿主菌遗传背景和生理特性清楚，有多种工程菌株可供选择②原核细胞繁殖能力强，操作简便、省时③大规模发酵成本低，生产潜力大④表达水平一般较真核系统高，且下游工艺简单、易于控制目前九十七页\总数一百一十六页\编于十六点原核表达系统的主要缺点：①原核细胞缺乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰系统（如糖基化、磷酸化等），因此，针对这些需经修饰的蛋白，无法用原核表达体系获得有活性的产物。②目的基因不能是含有内含子的DNA。③细菌本身产生的内毒素等热原不易去除干净，为产品纯化增加了难度。④蛋白的高水平表达常形成包涵体，提取和纯化步骤繁琐，而且蛋白复性较困难，容易出现肽链的错误折叠等问题。

目前九十八页\总数一百一十六页\编于十六点(二)真核细胞表达体系利用多种

真核细胞表达外源蛋白与原核表达体系相比，真核表达体系（特别是以哺乳类细胞作为宿主细胞的表达体系）具有如下优点：

①目的基因既可是基因组DNA，也可是cDNA，转录后能进行加工。②目的基因的表达可受到更严格地调控，能对所表达的蛋白质进行加工修饰，确保二硫键的精确形成，能正确进行糖基化、磷酸化、寡聚体的形成等加工。③可使蛋白进行分泌表达，从而有利于蛋白的分离纯化④所表达的目的蛋白不易被降解，且对宿主细胞的影响较小。

目前九十九页\总数一百一十六页\编于十六点与原核表达体系相比，真核表达体系也存在诸多不足：

①宿主细胞繁殖速度慢，培养条件要求高②蛋白表达水平低③整个操作过程复杂、费时、成本高目前一百页\总数一百一十六页\编于十六点常用的真核表达体系酵母表达体系昆虫细胞表达体系哺乳类细胞表达体系各种表达体系各有其优缺点，应根据具体需要进行选择本内容详见讲义P43-46目前一百零一页\总数一百一十六页\编于十六点

第五节

基因工程研究的进展及应用

目前一百零二页\总数一百一十六页\编于十六点一、基因工程研究进展

生物生命学科进入重造、定向改造、创造生物遗传性状和物种的新时代。目前一百零三页\总数一百一十六页\编于十六点

包括质粒、噬菌体、病毒、粘粒（质粒+噬菌体）、染色体及染色体与质粒的整合系统，线粒体及叶绿体也有各自构建的载体系统。

可以分别用于细菌、酵母、植物及动物的基因工程中。从应用目的上分为通用克隆载体、大片段克隆载体，cDNA克隆载体及各种表达载体。目前正在发展真核生物强表达载体和基因定位整合的克隆载体。1.构建了大量、不同类型的载体系统

目前一百零四页\总数一百一十六页\编于十六点

2.基因工程受体系统日趋全面

从早期大肠杆菌和酵母受体细胞，到各种真核生物（植物、动物）细胞系统。

现在正在利用转基因技术，以动、植物个体作反应器进行目的基因的表达。对受体的优化和选种，也是研究方向之一。目前一百零五页\总数一百一十六页\编于十六点3