高效液相色谱法5

20.1概述一、高效液相色谱的特点二、高效液相色谱的分类目前一页\总数三十七页\编于二十二点分析对象气相色谱：气体和沸点较低的化合物，占有机物总数20%高效液相色谱：高沸点、热稳定性差、分子量大的物质，占有机物总数80%流动相气相色谱：对组分没有亲和力的惰性气体，对分离选择性几乎无影响高效液相色谱：可选用不同极性的液体；选择余地大；对分离影响大（与组分或固定相均作用）色谱柱温气相色谱：一般较高高效液相色谱：通常为室温高效液相色谱vs气相色谱目前二页\总数三十七页\编于二十二点一、高效液相色谱的特点高压：150-350105Pa高速：一般<1h,<1min.高效：柱效高高灵敏度：10-9g（紫外检测器）

10-12g（荧光检测器）成本高、环境污染、梯度洗脱操作复杂；缺少灵敏度高的通用型检测器；复杂样品分离，缺少总理论塔板数达数十万的色谱柱；受压易分解或变性的生物样品。优点：局限：高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析目前三页\总数三十七页\编于二十二点二、高效液相色谱的分类分配色谱吸附色谱离子交换色谱尺寸排阻色谱疏水作用色谱按分离原理制备色谱柱内径>10mm半制备色谱柱内径>5-10mm分析型色谱柱内径<5mm按分离规模目前四页\总数三十七页\编于二十二点20.2高效液相色谱仪目前五页\总数三十七页\编于二十二点1.流程一、流程及主要部件目前六页\总数三十七页\编于二十二点高压输液系统进样系统分离系统检测系统附属系统2.主要部件目前七页\总数三十七页\编于二十二点(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa；为获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一；具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。柱塞式往复泵目前八页\总数三十七页\编于二十二点(2)梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。目前九页\总数三十七页\编于二十二点(3)进样装置

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：目前十页\总数三十七页\编于二十二点(4)高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。目前十一页\总数三十七页\编于二十二点匀浆法装柱示意图目前十二页\总数三十七页\编于二十二点高效液相色谱填料填料的热力学特性影响色谱柱的选择性填料的动力学性质或结构特点影响色谱柱的效率（颗粒的大小、形状、均匀性、比表面积；孔径、孔体积等）。基质无机基质材料硅胶(silica)、氧化铝、氧化锆、氧化钛、羟基磷灰石、多孔玻璃、多孔石墨碳等有机基质材料：天然多糖凝胶（如葡聚糖系、琼脂糖系等）高聚物树脂（如交联苯乙烯树脂、交联聚甲基丙烯酸酯类树脂等）特点目前十三页\总数三十七页\编于二十二点颗粒状整体柱微孔---孔径<2nm；中孔---孔径<50nm,>2nm；大孔---孔径>50nm使用中孔和大孔填料；微孔易造成色谱峰拖尾物理形态目前十四页\总数三十七页\编于二十二点(5)液相色谱检测器溶质性质检测器：对被分离组分的物理或化学特性有响应紫外、荧光、电化学检测器等总体检测器：对试样和流动相总的物理或化学性质有响应示差折光检测器、电导检测器等分类紫外光度检测器(ultravioletphotometricdetector)光电二极管阵列检测器(photo-diodearraydetector)荧光检测器(fluorescencedetector)示差折光检测器(differentialrefractiveindexdetector)蒸发光散射检测器（evaporativelightscatteringdetector)电导检测器(electricalconductivitydetector)常用检测器目前十五页\总数三十七页\编于二十二点a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高、线性范围宽；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

目前十六页\总数三十七页\编于二十二点它与固定波长紫外检测器的主要差别在于使用一个连续光源（如氘灯），以光栅（或棱镜）分光。光源发出的复合光（从190nm至600nm附近），光栅分光能够随意选择定的检测波长以匹配被测物质的最大吸收波长。目前十七页\总数三十七页\编于二十二点b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。目前十八页\总数三十七页\编于二十二点二极管阵列检测器可以记录190nm-900nm波长吸收光谱数据，可直接贮存色谱图中每一个点的吸收光谱。光源发出的光，通过透镜把光聚焦在检测池上。从检测池出来的光，通过透镜、狭缝到全息光栅上，经光栅分光后由一排光电二极管接收并转换为电信号，贮存于计算机中。DAD的最大优点在于利用ＵＶ光谱识别并进行纯度分析，还可以画出保留时间、波长和吸光度的三维立体空间谱图等，这是目前较先进的紫外检测器。目前十九页\总数三十七页\编于二十二点光电二极管阵列检测器目前二十页\总数三十七页\编于二十二点c.示差折光检测器除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；目前二十一页\总数三十七页\编于二十二点d.荧光检测器高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；目前二十二页\总数三十七页\编于二十二点20.3高效液相色谱固定相和流动相目前二十三页\总数三十七页\编于二十二点一、液相色谱固定相（1）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；

1.液-液分配及离子对分离固定相目前二十四页\总数三十七页\编于二十二点（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N目前二十五页\总数三十七页\编于二十二点化学键合固定相的特点A、传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；B、寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；C、选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；D、有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；

目前二十六页\总数三十七页\编于二十二点2.液-固吸附分离固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；

目前二十七页\总数三十七页\编于二十二点3.离子交换色谱分离固定相

结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）

树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）目前二十八页\总数三十七页\编于二十二点4.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。目前二十九页\总数三十七页\编于二十二点二、液相色谱的流动相1.流动相特性

（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。目前三十页\总数三十七页\编于二十二点2.流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；

按极性分：极性、弱极性、非极性；

按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。目前三十一页\总数三十七页\编于二十二点3.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常