第二章之种子培养

第二章之种子培养第1页，共43页，2023年，2月20日，星期三第一节种子制备工艺

实验室准备阶段生产车间阶段放罐，后处理产品第2页，共43页，2023年，2月20日，星期三第3页，共43页，2023年，2月20日，星期三第4页，共43页，2023年，2月20日，星期三第5页，共43页，2023年，2月20日，星期三一级种子发酵罐二级种子发酵罐第6页，共43页，2023年，2月20日，星期三第7页，共43页，2023年，2月20日，星期三种子扩大培养概念：将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。第8页，共43页，2023年，2月20日，星期三

种子质量的优劣对发酵生产起关键作用。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。发酵罐(几十或几百立方米)按10%接种量种子液(几或几十立方米)由实验室制备到车间生产的过程第9页，共43页，2023年，2月20日，星期三作为种子的要求：1)菌种活力强，移种后能迅速生长，迟缓期短2)生理性状稳定3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求4)无杂菌污染5)保持稳定的生产能力第10页，共43页，2023年，2月20日，星期三一、实验室种子制备接入斜面/平板，培养成熟后，挑选孢子，再一次接入斜面/平板，进行活化。(两次转接)A、砂土管或冷冻干燥管菌种活化第11页，共43页，2023年，2月20日，星期三

可采用固体培养基培养孢子，直接作为种子罐的种子。

举例:产黄青霉菌，采用大米或小米为固体培养基，装入摇瓶、灭菌，耍注意控制米粒含水量，使米粒不粘不散。接入孢子，25-28℃培养14d。培养结束，将孢子瓶于真空下抽去水分，使含水量10％以下，冰箱保存备用。B、产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种第12页，共43页，2023年，2月20日，星期三可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡培养，获得菌丝体，作为种子。

例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种第13页，共43页，2023年，2月20日，星期三生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。斜面菌种于32℃，培养18-24h，即可移入250mL摇瓶液体培养基，32℃培养12h，即可作种子罐种子。

例如：谷氨酸棒状杆菌。D、不产孢子的细菌第14页，共43页，2023年，2月20日，星期三一般保存在麦芽汁琼脂培养基或MYPG培养基的斜面上，4℃冰箱保存.每年移种3-4次。斜面菌种→接入含10mL麦芽汁试管→25-27℃培养2-3d→扩大至三角瓶→25℃培养2d→移至含5-10L麦芽汁的罐→15-20℃培养3-5d→含100L麦芽汁的发酵罐。E、生产啤酒的酵母菌MYPG培养基：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨,10g葡萄糖,20g琼脂,1L水。第15页，共43页，2023年，2月20日，星期三二、生产车间种子制备采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。种子罐培养原则：第16页，共43页，2023年，2月20日，星期三摇瓶菌丝体种子：种子罐之间或发酵罐间的移种：接种方法：可在火焰保护下接入种子罐或采用压差法接入。主要采用压差法，由种子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降至零.Why?第17页，共43页，2023年，2月20日，星期三从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种种子罐种子罐种子罐第18页，共43页，2023年，2月20日，星期三从种子罐接种到发酵罐第19页，共43页，2023年，2月20日，星期三生产车间种子制备工艺可控参数:种子罐级数种龄接种量第20页，共43页，2023年，2月20日，星期三A种子罐级数的确定种子罐级数指制备种子需扩大培养的次数.种子罐级数的意义：

种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少移种带来染菌机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数不宜过少。第21页，共43页，2023年，2月20日，星期三

种子罐级数随菌种及规模而定，也与工艺条件有关。优化种子罐培养条件，加速孢子发芽及菌体繁殖，也可减少种子罐的级数。第22页，共43页，2023年，2月20日，星期三1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。

例如：谷氨酸生产中，菌接入种子罐32℃培养7一10h，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。第23页，共43页，2023年，2月20日，星期三2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。

例如：青霉素孢子悬液接入一级种子罐（发芽罐）于27℃培养40h，孢子发芽，长出短菌丝。再移至第二级种子罐（繁殖罐），27℃培养10-24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。

第24页，共43页，2023年，2月20日，星期三3.生长更慢的菌种

链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养。在小型发酵罐(5—30L)进行试验时，也有采用直接孢子或菌丝体接入罐中发酵，称一级发酵。第25页，共43页，2023年，2月20日，星期三

接种龄以菌丝处于对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。

过于年轻的种子：前期生长缓慢、发酵周期延长、产物形成推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵的情况。

过老的种子：会引起生产能力下降，菌丝过早自溶。

不同品种或同一品种的工艺条件不同，接种龄是不一样的，要经试验，确定最适接种龄。B接种龄第26页，共43页，2023年，2月20日，星期三嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。第27页，共43页，2023年，2月20日，星期三移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量大小决定于菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。

例如：抗生素发酵的最适接种量为7-15％，有时可增加到20-25％。而谷氨酸发酵只需1％。C.接种量第28页，共43页，2023年，2月20日，星期三大接种量：可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前，且生产菌迅速繁殖，可减少杂菌生长机会。

原因：??(a、种子量多b、种子液含大量水解酶类，利于利用基质)接种量过多：

往往使菌丝生长过快、培养液粘度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成。第29页，共43页，2023年，2月20日，星期三嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶：1％接种量产酶活力最高，超过4％酶产量明显下降。第30页，共43页，2023年，2月20日，星期三接种量过小：

除了延长发酵周期外，往往还会引起其他不正常情况。

例如：在头孢菌素生产中，由于接种量过小，会产生大量菌丝团，而使产量降低，

但有的抗生素如制霉菌素，用1％接种量比用10％接种量的效果好，而0.1％接种量与1％的效果相似。第31页，共43页，2023年，2月20日，星期三

近年来，生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。

双种法：有的产品采用二只种子罐接一只发酵罐，如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8％，而且达到产量高峰的时间提前。

倒种法：即以适宜的发酵液倒出适量，给另一发酵罐作种子．例如链霉素发酵中，使用倒种法比单种的发酵单位提高12％。而四环素发酵采用双种效果并不显著。第32页，共43页，2023年，2月20日，星期三影响种子质量的因素种子质量的判断种子质量的控制第二节种子质量的控制第33页，共43页，2023年，2月20日，星期三A原材料质量

生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。(什么引起原料质量波动?)

影响种子质量的因素答：原材料质量的波动，起主要作用的是无机离子含量不同，如微量元素镁、铜、钡能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。

第34页，共43页，2023年，2月20日，星期三例1：四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。例2：制备霉菌用的大(小)米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。

例3：蛋白胨加工原料不同，对孢子影响也不同。

例4：琼脂的牌号不同，其中含无机离子的差别而引起孢子质量的变化。

例5：水质的硬度、污染程度对生产均有影响。第35页，共43页，2023年，2月20日，星期三

B培养条件

(1)温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。

例如：土霉素生产菌种在高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后，表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。第36页，共43页，2023年，2月20日，星期三(2)湿度斜面培养基湿度对孢子数量和质量有较大影响。

例如：土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子制备时发现：北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含少量水分的试管斜面下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，孢子稀少。在气温高湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。第37页，共43页，2023年，2月20日，星期三(3)通气量

种子罐有足够的通气量可以提高种子质量。

例如:青霉素生产，将通气充足和不足情况下得到的种子分别接入发酵罐，发酵单位相差1倍。

但也有例外

例如：土霉素生产中，一级种子罐的通气量小对发酵有利。第38页，共43页，2023年，2月20日，星期三C斜面冷藏时间

例如：土霉素生产菌种，孢子斜面培养4d即于4℃冰箱保存，冷藏7-8d菌体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏，20d未发现自溶。

例如：链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18％。斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。第39页，共43页，2023年，2月20日，星期三为保证种子质量，除保证培养条件外，还要定期取样测定一些参数，以观察基质的代谢变化及菌丝形态是否正常。

1).pH2).培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量3).菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗粒等)4).其他参数，如接种前抗生素含量、某种酶活力等种子质量的判断测定的参数:第40页，共43页，2023年，2月20日，星期三用酶活力来判断种子的质量是一种新的尝试：

例如：土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系。淀粉酶活力高的，接入发酵罐后土霉素发酵单位也高，反之则低。第41页，共43页，2023年，2月20日，星期三A菌种稳定性的检查生产菌种，必须保持稳定的生产能力，虽然菌种保