专利申报fgffgf18说明书一种重组人成纤维细胞生长因子FGF 18的生产方法

FGF18是FGF的一个新成员，是一种可分泌蛋白。1998年，科学家Ohbayashi首次从老鼠胚胎中分离得到了FGF18。人FGF18编码一个207氨基酸组成的蛋白序列，分子质量约为23kDa人FGF18定位于5q34，共有5个外显子与已发现的FGFs其他成员有30%~70%的同源性序列分析结果表明，FGF18是由207个氨基酸组成的高度保守的序列，小鼠FGF18与99.5%99%的同源性。在结构上，FGF18FGF8、FGF17相似，为同一亚成员，具有70%~80%的氨基酸序列同源性。FGF18的表达与FGF8、FGF17的空间表达形式类似，但在时空表达形式上，FGF18FGF8、FGF17不完全相同。其在骨骼生长发育过程中扮演体外和体内的多项研究表明，FGF18在形态发生、血管形成、肿瘤生长和其他细胞发育过程中也发挥1818。据，18在长骨发育过中的软膜内和颅发育过中成骨充质细中显著表达。18在骨骼发育的具有可替代作用此外，18敲除的鼠肋骨形导致腔体积的减，可能呼衰竭，被怀疑是18敲除鼠早期的原之一，时还FGFR3小鼠中未观察到的。因此，在抑制作用。Kapadia等的研究进一步证实了，FGF18在胚胎发育期可抑制骨软骨细胞增殖和分化。恰恰相反在成年18在其他软骨组（除了长面的骨细胞有正向用据，18Elswrh等研究显示介转移18到小鼠外耳激细的增殖致软细胞数的增蛋白糖表达以及型胶原蛋白的上升。最近的显示，在软骨细胞增殖过程中，18合成作用增强可18（M）外，Shimokawa等的研究进一步强调，FGF18与消化系统保持平衡的相关性，并提出了提高FGF18表不对称胚胎的发育。（HuMCetal.MolCellBiol,1998,18(10):6063-6074;OhbayashiNetal.JBiolChem1998,273(29):18161-18164;IwataTetalHumMolGenet2000,9(11):1603-1613;OhuchiHetalDev,2000,95(1-2):55-66;EllsworthJLetal.OsteoarthritisCartilage,2002,10(4):308-320;OhbayashiNetal.GenesDev,2002,16(7):870-879;ShimoakaTetal.JBiolChem,2002,277(9):7493-7500;DiannDSetal.DevDyn,2003,226(4):663-674;UsuiHetal.BiochemBiophysResCommun,2004,322(3):887-892;KatohMetal.IntJMolMed,2005,16(3):493-496;KawanoMetal.JInvestDermatol,2005,124(5):877-885;MooreEEetal.OsteoarthritisCartilage,2005,13(7):623-631;SmithSMetal.ArchBiochemBiophys,2007,468(2):251;GrecoVetal.CellStemCell,2009,4(2):155-169;BehrBetal.TissueEngPartA,2011,17(15-16):2061-2069;PlikusMVetal.JInvestDermatol,2012,132(5):1321-1324;LongFetal.ColdSpringHarbPerspect2013,因此，FGF18的发现对于骨骼性疾病以及症的治疗有着重要意义。对于FGF18的研究以及白表达水平低，同时很难具有高活性的蛋白。这些已经构成了FGF18基础研究和临床应用的瓶颈问题。Huetal.利用哺乳动物细胞表达FLAG的FGF18，然而，哺乳动物表达细胞更加复杂和昂贵的，很难利用大规模发酵过程。而且，FLAGFGF18的生物活性。2012年，Jeonetal.利用大肠杆菌TOP10细胞表达His6-FGF18，虽然添加了His有利于蛋白的纯化，但增加了免疫原目前国际上的FGF18大肠杆菌表达系统生产工艺，为方便纯化都融合（His,GST,Trx等）来CM-SepharoseFF阳离子交换和肝素亲和柱分离纯化目的蛋白，最终获得蛋白纯度超过95%的具有较高生物学活性的FGF18重组蛋白，为今后开展生产奠定了基础。FGF18DNA的载在本发明的第一方面，提供了一种优化后的表达人成纤维细胞生长因子-18的序列，提高了成纤维细胞生长因子-18的表达量。在本发明的第二方面FGF18正确编码序列应用BamHI和NdeI酶切后插入到表达载长因子-18的DNAOrigima(DE3)。该菌体的能促进成纤维细胞生长因子-18蛋白的二硫键正确折叠。FGF18；通过低温高速离心获得含外源蛋白FGF18pET3c-rhFGF-18，或者所述的宿主细胞是大肠杆菌。司)；2：pET3c-FGF-18质粒；3：pET3c-FGF21NdeI+BamHI酶切。2、3hr；6、7：22、3hr5hFGF18Western检测图1：FGF18核苷酸序列表在另一优选例中，用本发明优化的rhFGF-18Origima(DE3)，经高密度发酵培养，IPTG诱导，rhFGF-18以可溶、活性形式存在，同时简便纯化工艺，通过超声破碎方法，即可得到纯度达95％的纯品，获得高表达、高得率、极具价值的一种生产rhFGF-18的方法Origima(DE3)。位点，然后克隆入含IPTG诱导的启动子的表达质粒中，转化与表达载体相容的大肠杆菌宿主菌，经筛选鉴定后获得工程菌。本发明的工程菌属于IPTG诱导型。（DONH4Cl0.4-1％。0.1-1mM。50.1-0.52-5％。溶氧（DO）3050％以上；pH6.8-7.0，诱导阶段控制在7.2-7.435-37℃23-25℃；在发酵表达rhFGF-18CM-SepharoseFF在本发明的一个实例中，选择了有助于真核在原核细胞中正确翻译的IPTG诱导型启动子的18工程菌（大肠杆菌。经高密度发酵培养，IPTG诱导，rhFGF-18以可溶形式存在；表达占菌体总18rhFGF-18100mg95％以上。纯化后原液加入适当辅料，制成rhFGF-18的冻干粉剂。初步稳定性试验表明，该粉剂稳定。品约100mg或，因此适合生产。化工序，提高了成品率和蛋白的活性，使大规模生产rhFGF-18成为可能。根据已知的rhFGF-18的天然氨基酸序列，按照大肠杆菌子偏爱性并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，在不改变氨基酸序列的条件下，设计rhFGF-18PCR扩rhFGF-18的全长目的序列。宿主菌为大肠杆菌Origima(DE3)。参见图3，用NdeI和BamHI双酶切分别处理rhFGF-18和表达载体pET3c，37°C酶切3小T4DNA16°C连接过夜。连接产物转化进入大肠杆菌，在含有氨苄青酶及NdeI+BamHI在37°C反应3小时，得到在pET3c中插入了rhFGF-18的重组质粒pET3c-PCR4NdeI+BamHI双酶切时，621bppET3c中。4行正、逆向序列分析，委托Invitrogen公司进行序列的测定，证实克隆序列与设计序列完全一致。摇瓶试验，该工程菌培养后，经IPTG325％左右。218株将含有目的的工程菌分别进行摇瓶试验经IPTG(或糖)诱导3小时后含质粒pET3c-5％左右。这表明，pET3c-rhFGF-18表达载体优于其他表达载体。3挑取实施例1中的转入pET3c-rhFGF-18的大肠杆菌Origima(DE3)单克隆，接种到含50mlLB1000mL8-10hOD6006-81:10上罐发浓度称量LB11LB1５1５21将含有目的的表达菌株的甘油菌接种到含50mLLB培养液的250mL三角烧瓶中，培养3-4h，待OD600达到0.8-1.0，按1:10的比例接种于含250mL改良液的1000mL三角烧瓶中，培8-10hOD6006-81:10上罐发酵，流加碳源（葡萄糖或甘油6.8-7.037°C、DO>30OD60015-18lmMIPTGSDS检测(并扫描)、测定蛋白含量。50ghFGF-18的生产效率。rhFGF-184°C5000rpm10min10mL/g加入裂解缓冲液20mMTris-HC1mMEDTA,1mMPMSF0.05%80,5mMβ-巯基乙醇）重悬菌体，在冰浴下超声10min，1200rm清溶液存于EP管内，保存于冰上，用于下一步的分离纯化。11(阳离子交换)：层析介质：CM-SepharoseFF缓冲液：溶液APB(20mM，pH6.5+25mMBPB(20mM，pH6.5+1.2MCM阳离子交换柱。：上样后用10CV的溶液A层析柱梯度：后用20CV将溶液B从0％升至100％，时间梯度90min。FGF-18样品峰。A：PB20mM，pH6.5)+25mMB：PB(20mM，pH6.5)+1.5M：上样后用10CV的溶液A层析柱梯度：后用20CV将溶液B从0％升至100％，时间梯度90min。FGF-21样品峰。MTThFGF18NIH3T3hFGF18NIH3T3hFGF1实施例1FGF18的PCR合成及序列测根据FGF18去除信号肽的氨基酸序列，添加本实验中所用到的酶切位点，同时利用大肠菌偏进行优化，交于合成公司合成。再次，利用软件PrimerFinder及DNASTAR设计FGF18引物，共2条，目的（hFGF18）通过PCR扩增获得。最后通过菌落PCR、NdeⅠ-BamHFGF21基因合成PCR扩增体系10*EXTaqEXTaq反应参数：94°C 0.5min55°C 0.5min72°C 1min经1%琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性条带后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收，得到含有目的基因FGF18的片段。菌液PCR验证体系：10*EXTaqEXTaq总体 反应参数：94°C 0.5min55°C 0.5min72°C 1min样 体经1%琼脂糖凝胶电泳检测观察在621样 体NEBbuffer4

总体 37°C，酶切3h1%琼脂糖凝胶电泳检测观察在621bp处是否出现目的条带。以F，R为引物，通过PCR扩增获得含有FGF18的。用NdeI和BamHⅠ双酶切，与同样用pET-3cE.coliDH5αPCR和酶切鉴定初步正确的重组质粒鉴定。经证实，本发明设计合成的pET3c-FGF18核苷酸序列正确。3FGF18蛋白的获得将正确的pET-3c-FGF18转化到大肠杆菌Origima(DE3)感受态细胞中，氨苄青霉素抗性平OrigimaDE3pET-3cFGF18单菌落，接种到LB培间等表达条件的优化。经研究证实，OD600值为0.5时，1mMIPTG在25°C诱导12h，超声波（100w，上清，先进行CM-SepharoseFF纯化，用20MPB（pH6.5，25mmol/LNaCl）和20Mm1.2MNaCl）进行梯度洗脱。收集吸脱峰组分，把目的组分再进行肝素亲和树脂亲和层析，用结合缓冲液（20mMPB，pH6.5，25mMNaCl）平衡Ni-NTA树脂，将裂解液到平衡好的树脂柱中，上样完毕后用洗涤缓冲液（20