医疗器械无菌检查

1医疗器械-无菌检查

江苏省医疗器械检验所

2主要内容无菌定义及无菌检查定义无菌检验依据试验主要设备实验环境条件及人员要求培养基种类及配制要求培养基适用性检查试验菌种及菌液制备无菌检查方法验证供试品无菌检查及结果判断

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无菌定义:无活微生物的状态。无菌检查定义：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。（1）无菌定义4

（2）无菌检验依据本规范选用于《中国药典》2010年版二部附录XIH无菌检查法。GB/T14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法，第二部分：生物试验方法中规定的无菌试验方法。5（3）试验主要设备超净工作台细菌培养箱霉菌培养箱立式高压蒸汽灭菌器台式高压蒸汽灭菌器显微镜生物安全柜电热恒温干燥箱集菌仪6

试验仪器（1）-超净工作台7

试验设备（2）--隔水式恒温培养箱8

试验设备（3）----霉菌培养箱9试验设备（4）-立式高压蒸汽灭菌器10试验设备（5）--台式蒸汽灭菌器11试验设备（6）--显微镜12试验设备（7）-生物安全柜13试验设备（8）Equinox全自动无菌检验系统14

（4）实验环境条件要求：

无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。15

（4）实验人员要求：

菌检人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。

16（5）培养基种类及要求

硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基2012年12月1717（5）培养基种类及要求

无菌检查：硫乙醇酸盐流体培养基2012年12月1818（5）培养基种类及要求

无菌检查：改良马丁培养基：19（5）培养基种类及要求

保存时间：

制备好的培养基应保存在：2℃～25℃、避光非密闭容器中：一般在三周内使用密闭容器中：一般可在一年内使用20（5）培养基种类及要求

一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，配制时须迅速，以免吸潮影响称量的准确性，同时需注意灭菌后培养基的pH值应符合规定，否则必须校正后灭菌使用。新鲜配制的培养基，应符合《中国药典》规定的配方，对培养基进行挑选。21（5）培养恨基种类及妄要求硫乙醇酸私盐培养基热：属于流诵体培养载基，即当在液体贝培养基己中加入0.05外%～0.0匙7%的琼脂，增加了吴培养基的于粘度，降饰低培养基查中的含氧烛量，使培容养基在一葱段时间内搜保持厌氧桌的条件，抱有利于厌衫氧菌的生筛长。硫乙胁醇酸盐培摊养基分装敬在适宜的瘦容器中，科其粉红色档的氧化层适合需气削菌的生长稿，在供试饥品接种前激，培养基千的氧化层县的颜色不扔得超过培乓养基深度猛的1／5，调PH值灭菌捉后为7.1沃±0.意2，分装云，灭菌杏。硫乙醇柴酸盐培丹养管置君：30～35℃培养14天。22（5）培养基种类及脾要求改良马以丁培养史基：取培养基睬成分混合虚，微温溶鄙解，调节PH值约为6.8，煮沸膨，摇匀琴，调PH值灭菌饶后为6.4悟±0.桶2，分装怎，灭菌仿。改良马丁钥培养基：置23～28℃培养14天。23（5）培养惧基种类及要铁求培养基装姥量：对于采饿用直接青接种法配检查的液体样品，培擦养基的装给量与供试钉品装量相新关，应根黎据供试品公接种量确却定培养基辞的装量，杏使供试品部接种体积征不大于培茂养基的10%。对于采族用直接尚接种法宫检查的固体样品，培李养基的装断量均为100瞒ml；一次性悉医用材料票及医疗器授具，若医妥疗器具体叮积过大，受培养基的贤装量可200辞0ml以上，撒已将其然完全浸姻没为准坊。对于采用薄膜过滤狮法检查的委样品，摊封闭式哈薄膜滤叙器的培割养基装烂量为100配ml。24（6）培养基欣适用性制检查新购的培什养基或自箩配的新鲜坡培养基要墙求：无菌性截检查：每批培缝养基随举机取不望少于5支（瓶）久，培养14天，应游无菌生时长。灵敏度检棕查：其质量辩均应符科合灵敏度樱检查要迈求。用于侨培养基献灵敏度截检查的临菌种如跑下：菌广种的传惨代的次牲数不得驳超过5代（从菌荡种保存摸中心获谜得的冷道冻干燥丝式菌种为0代）。25（6）培养基渴适用性努检查菌种：砌试验用蜓菌株及树菌液制域备：金黄色削葡萄球车菌[CMC家C(B)源2600狂3铜绿色竞假单胞朱菌[CMC俩C(B)眨1010钢4]大肠埃杰希菌[CM丽CC(凳B)4愉410纤2]枯草杆菌[CMC炎C(B)跌6350洗1]生孢梭筒菌[CMC筝C(B)孩6494狼1]白色念压珠菌[CM微CC(毒F)9泼800荐1]黑曲霉[CM暂CC(缘瑞F)9会800吩3]菌种的要盖求：不得超过5代。采用创适宜的方恶法保存；烈并以保证斗试验菌株葵的生物学誉特性。26（6）培养基适磨用性检查菌液制季备一般当汪日使用街。取金黄色葡萄妖球菌、铜绿假单胞脑菌、枯草芽孢杆扒菌，少割许接种判至营养滨肉汤基跨中，生孢梭菌的夏新鲜培编养物少讨许接种墓至硫乙啄醇酸盐虫流体培散养基中恐，30～35℃培养18～24h；白色念珠菌的徐新鲜培养课物接种改匀良马丁培留养基中，23～28℃培养24～48h，上述汪培养物名用0.9%无菌氯牙化钠溶遇液制成染含菌量惧小于100叮cfu括/ml菌悬液；黑曲霉菌斜兼面的新鲜凝培养物接某种至改良佣马丁琼脂昼斜面培养雅基上，23～28℃培养5～7天，使梳大量的饥孢子成企熟。加接入3～5ml含0.0搂5%（ml/抖ml）聚山销梨酯80的0.9%无菌氯化辫钠溶液，谊将孢子洗中脱。然后闪用适宜的凶方法吸出贯孢子悬液晌至无菌试识管中，用奇含0.05铁%（ml/m执l）聚山倘梨酯80的0.9持%无菌氯化享钠溶液制姻成小于100c好fu/m此l的孢子荣悬液。象（见表捐）27（6）培养基适道用性检查《中国药停典》201亡0年无菌拦检查验京证试验材中使用7株菌见寸下表菌种接种培养基培养温度℃培养时间金黄色葡萄球菌营养肉汤或者普通斜面30～35

18～24h铜绿假单孢菌

枯草芽孢杆菌大肠埃希菌（无）生孢梭菌硫乙醇酸盐培养基白色念珠菌改良马丁或者普通斜面23～28

24～48h黑曲霉改良马丁斜面23～285～7d28（6）培养基别适用性锹检查培养基接私种金黄色葡挖萄球菌2支铜绿假丝式单胞菌2支硫乙醇掉酸盐流韵体培养烤基缩慧枯草芽宫孢杆菌2支生孢梭菌2支9支培挣养基装耗量12m倘l，空白对照1支。分别接尸种小于100c河fu/m摔l金葡、铜牌绿、枯草冶、生孢各2管，另1支不接种亏做空白对肚照，培养3天，逐崭日观察旁结果。29（5）培养基匆适用性驻检查培养基可接种白色念株剃菌2支改良马丁彻培养黑曲霉2支（5支培养基夜装量9ml，其中1支做空圣白对照弃）分别接种括小于100蜜cfu伪/ml白色、满黑曲各掉两支，另1支不接种泥做空白对驱照。培养5天，逐日阅观察结果脖。30（6）培养基适维用性检查结果判绩断空白对照眼管应无菌紫生长，若管加菌的培痰养管均生纺长良好，经判该培养务基的灵敏剧度检查符盖合规定。31（7）试验(验证)菌种及菌连液制备菌种：试扭验用菌株声及菌液制幼备：金黄色葡狐萄球菌[CMC披C(B)找2600飞3大肠埃坦希菌[CM编CC(邪B)4跳410洲2]枯草杆菌[CMC想C(B)久6350巡寿1]生孢梭菌[CM偶CC(站B)6腾494宇1]白色念呢珠菌[CMC露C(F)慨9800敲1]黑曲霉[CM盘CC(艘F)9没800娱3]32（6）试验菌仗种及菌液宽制备10倍堵梯度稀胸释选择适响宜的3尼个稀释乓级别要求＜1两00cf该u/ml33（7）无菌检趴查方法验与证验证准知备条件展：稀释液吉、冲洗慨液及其王制备方赵法0.1％蛋白马胨水溶皆液pH7.军0氯化钠—蛋白胨缓访冲液制备的厅菌液，镰应当日放使用。34（7）无菌检赵查方法验换证目的:证明所增采用的商方法适其合于该傲供试品某的无菌筛检查确认供控试品在纤该实验墨条件下帝无抑菌穷活性或竹其抑菌返活性可芽以忽略异不计。确保在实饶际检验条沾件下，该败供试品的立无菌检查呜法的准确敌性、有效邀性和重现雪性。验堡证时，按“供试品身的无菌鉴检查”的规定及楚下列要求硬进行操作卫。对每一钉试验菌应蛛逐一进行捞验证。35（7）无菌辛检查方耍法验证菌种及菌梢液制备宜：除大肠埃膀希菌（Esch钟eric楼hia逗coli）[CMC宿C(B)乔44腊102〕外，金黄妖色葡萄球原菌、枯草芽孢隶杆菌、生孢梭菌江、白色念背珠菌、作黑曲霉饮同培养幻玉基灵敏投度检查应。大肠地埃希菌才的菌液瓶制备同诸金黄色镰葡萄球系菌。方法验证唉试验与灵季敏度检验粘所有菌种晃区别：大肠埃希点菌代替铜绿假号单胞菌驶。36（7）无菌检备查方法验撑证菌液制纳备：金黄色逐葡萄球亏菌（大伯肠埃希葡菌、枯休草芽孢匙杆菌)接种营养域肉汤（或拒营养琼脂奸培养基）生孢梭菌腹接种硫乙泪醇酸盐流巷体培养基30～35℃培养18～24小时；白色念珠扇菌接种改誓良马丁培雀养基（或捆改良马丁专琼脂培养爬基）23～28℃培养24～48小时上述培养适物用0.9％无菌贤氯化钠米溶液制正成每1ml含菌数彼小于l00货cfu餐(菌落形成冈单位)的菌悬喝液。黑曲霉歼接种改练良马丁白琼脂斜暴面培养恭基上，23～28℃培养5～7天，加柱入3～5ml润0.券9％无菌企氯化钠患溶液，笛将孢子县洗吸撞出孢子士悬液(用管口寨带有薄间的无菌凶棉花或福纱布能毅过滤菌送丝的无葛菌毛细蒙吸管)至无菌箩试管内洗用0.9％无菌氯韵化钠溶液渗制成每lml含孢子剂数小于l00蔑cfu的孢子铸悬液。37（7）无菌爪检查方肺法验证薄膜过滤辟法将规定量灵的供试品棚按薄膜过抓滤法过滤闯，冲洗，谦在最后一扒次的冲洗印液中加入送试验菌（务小于100c商fu），过滤甚。取出滤拉膜接种至坏相应的培否养基中，星或将培养念基加至滤督筒内。另顽取一滤桶务，不过滤蓄供试品，恨其它操作已同上，作励为对照.将含培内养基的塌容器按帖规定温努度培养3～5天。智各试验终菌及相扩应的培激养基逐极一进行想验证。（如下洞图示）38（7）无菌检疮查方法验场证薄膜过泪滤法规定量的冲供试品过滤硫乙醇酸丸盐流体培匙养基滤膜接种改良马丁圣培养基冲洗▲每种菌箩均作1管不含供摩试品管作声为对照加入试演验菌过滤39（7）无菌姻检查方担法验证直接接王种法取符合直话接接种法拌培养基用会量要求的垫硫乙醇酸组盐流体培飞养基8管，分别接接人小于l00c养fu的金黄色满葡萄球菌月、铜绿假亚单胞菌、脆枯草芽孢抹杆菌、生究孢梭菌各2管；取符弹合直接接沾种法培养岸基用量要豪求的改良乏马丁培养税基4管，分证别接入翁小于l00两cfu的白色念膊珠菌、黑监曲霉各2管。其施中1管接人德规定量冻的供试定品，另1管作为俊对照，赶按规定拣的温度利培养3～5天。（如朽下表）40（7）无菌检旗查方法验柜证-直接接种毅法方法验证所用菌种（药典2010版规定）金黄色葡萄球菌分别接种各菌种新鲜培养物至相应培养基中培养，将培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成菌悬液，浓度小100cfu/mL硫乙醇酸盐流体培养基8支：分别接种小于100cfu的金葡、大肠、枯草、生孢各2支，其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，培养3天。大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌改良马丁培养基4支：分别接种小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，培养5天。黑曲霉41（7）无菌电检查方俘法验证结果判断与对照商管比较顾，如含兵供试品汉各容器印中的试夕验菌均驰生长良像好，则狸供试品爸的该检麦验量在汽该检验熊条件下漆无抑菌极作用或铃其抑菌拜作用可痰以忽略煎不计，缩慧照此检居查法和些检验条胸件进行包供试品显的无菌巷检查。止如含供会试品的澡任一容珍器中微亮生物生正长微弱诱、缓慢挪或不生她长，则努供试品篮的该检钢验量在县该检验筝条件下脑有抑菌鞋作用。卵可采用卷：1)增加冲祖洗量，派或增加剥培养基猫的用量溉；2)使用中践和剂或艺灭活剂蹄、更换盖滤膜品甲种等方赴法，消依除供试是品的抑翠菌作用毫，并重印新进行钓方法验皂证。42（8）供试品络无菌检查在100级超净台呢内，应在疼酒精灯火轰焰周围，坝以无菌操符作法将规倾定量的供拘试品分别印接种至含愚硫乙醇酸闭盐流体培瓶养基（不亦少于15m优l/管）和昼改良马嘴丁培养坝基（不勉少于10ml核/管）的容邻器中。注意事年项：严格遵链守无菌蓄技术操幕作，切艳勿人为筛造成污愤染；试验器鼠具温度省不可过愁高以免段将可能时存在的酱菌烫死。43（8）供试品令无菌检查供试品包抓装须完好申无损，尤姿其是只有麻一层包装誉的样品。供试品若勉有两层（琴或两层以用上）包装阳的，进入贷无菌检验帅室需将外龟包装在传智递窗（或伟缓冲间）约拆除后，钳传入实验化室。开启洁魔净区紫扮外灯和散空气过毅滤装置跌并其工孤作1小时以乌上。操作人因员准备倘：带口望罩、帽拒子、穿勺专用无谨菌服、三鞋进入铅无菌室禽。每次试藏验中所粪用物品栽必须计翅划好，久并有备冠用44（8）供试品主无菌检查无菌检叉查法包等括：薄膜过滤糠法和直接头接种法。只要供逮试品性良状允许滨，应采习用薄膜享过滤法抚。进行沈供试品席无菌检潜查时，套所采用令的检验沸方法和司检验条漂件应与灰验证的傻方法相提同。45（8）供试品杠无菌检查细菌检测排管：硫乙醇台酸盐流戚体培养内基+供试品真菌检末测管：改良马丁其培养基+供试品阳性对雾照管：对应阳三性菌+对应培扇养基+供试品阴性对照筑管：应取相稼应的溶磨剂和稀逮释液或番冲洗液+培养基46（8）供试陵品无菌著检查检验数蚕量：是指一次婆试验所用成供试品最挤小包装容戒器的数量馅。一般情况时下，供试迷品无菌检局查若采用薄膜过篮滤法，应增跌加最小宗检验数腔量的1/2作阳性吸对照用及；若采驳用直接节接种法环，应增才加供试端品无菌漠检查时隐每个培列养基容边器接种锹的样品铁量做阳许性对照臂用。47（8）供试品暗无菌检查检验量：是指一蔽次试验传所用的批供试品戒总量（g或ml）。采用直接喂接种法时杀：若每支（屡瓶）供试瓣品的装量牛按规定足糟够接种两隆份培养基卸，则应分眠别接种硫衣乙醇酸盐泳流体培养其基和改良花马丁培养亏基。采用薄矮膜过滤誉法时：检验量应烟不少于直渴接接种法牌的供试品睬总接种量垦，只要供劳试品特性污允许，应掀将所有容换器内的全行部内容物书过滤。48（8）供试捆品无菌洋检查直接接络种法：每个容坊器中培展养基的旅用量应钥符合接踩种的供初试品体伟积不得期大于培妥养基体刷积的10％，同牺时硫乙哨醇酸盐拖流体培走养基每于管装量沉不少于15ml，改良凑马丁培塞养基每丧管装量僻不少于10ml。培养尼基的用兔量和高稠度同方安法验证姐试验；绵每种培牺养基接使种的管子数同供趴试品的嗓检验数扬量。4949（8）供试品竹无菌检查阴性对彩照：供试品蛙无菌检喷查时，解应取相获应溶剂梦和稀释梳液同法羡操作，控作为阴顾性对照押。阴性唤对照不烟得有菌尘生长。阴性对照漫：目的是挖验证相掠应溶剂钳和稀释雁液本身绳是否存肿在污染桥，防止底假阳性啄。5050（8）供试每品无菌标检查阳性对屡照：应根据供偏试品特性却选择阳性伍对照菌；消无抑菌作跪用供试品歼以金黄色纽奉葡萄球菌朝为阳性对象照菌。阳睛性对照试范验的菌液着制备同方差法验证试旬验，加菌赢量小于100挎cfu芳/ml，供试监品用量义同供试乱品无菌烧检查每田份接种树量相同弃。阳性帅对照管特培养48~72小时应生蛇长良好。阳性对胜照：目的是抚验证试妄验结果标可靠性焰，防止棋假阴性伤。5151（8）供试品退无菌检查薄膜过滤逆法：2010年版《中国药葵典》规定:只要供阻试品性自状允许伴，应采武用薄膜离过滤法榜。供试透品无菌卷检查所困采用的浸检查方葛法和检捎验条件蜡应与验狂证的方绩法相同械。在蠕动喜泵的作骗用下，尤被测产朗品通过晌装有带谋空气过检滤器的尺针头及器无菌管诵路直接蓄从样品瓜容器中烤进入滤术筒中，留免去了赚通常膜裁转移过掌程中易近产生的哗污染。无菌检查奖法中薄膜器过滤法所册用的滤膜胁孔径应不冰大于0.4繁5μm，直径娇约为50mm。5252（8）供试品嘱无菌检查水溶液么供试品取规定山量的供斩试液，率直接过质滤，或碎混合至片适量稀四释液的霜无菌容裳器内，析混匀，猜立即过轮滤。供试液经金薄膜过滤屈后，若需崭要用冲洗桃液冲洗滤代膜，每张览滤膜每次琴冲洗量为100震ml，总冲洗旅量不得超型过100迟0mL，以免分滤膜上钞微生物膜受损伤遭。冲洗后姑分别将100m闯L硫乙醇酸旱盐流体培变养基及改标良马丁培踪蝶养基加入旧相应的滤钳筒内，进行培篮养。5353（8）供试四品无菌脾检查直接接种忙与薄膜过内滤培养结开果：54表2上市抽验崇样品(液体制遮剂)的最少合检验量55表3上市抽验到样品（固喉体制剂）往的最少检价验量56（8）无菌检伸查结果判番断培养及观络察按规定奖的温度轻培养1