大豆Lea5基因的克隆与表达分析

大豆Lea5基因的克隆与表达分析何道一;周秀杰;张坤亮;夏仁杰【摘要】Inordertoinvestigatethemolecularbiologicalmechanisminvolvedingerminationofsoybeanyoungembryospromotedbyhightemperature(HT),bothyoungembryosofsoybeancultivar"Nipponbare”treatedwithHTandwithoutHTwereemployedtoscreenthedifferentialexpressiongeneswithmRNAdifferentialdisplayreversetranscription-polymerasechainreaction(DDRT-PCR).Inthisstudy,wereportedK6,oneofthedifferentialexpressiongenes.K6wasregardedashomologueofLea5gene(soybeancultivarWilliams82),becausetheyshared99%identicalnucleotides.BlastpanalysisshowesthattheputativeproteinofK6containsLEAtype-3motifsandisassignedtoLEA-3superfamily.AnalysisbyCLCProteinworkbench5softwarealsoshowesthattheputativeproteinhas113aminoacidresidueswithrelativeMW12.283kDandpI10.12.TheputativeproteinofK6hasnotypicalsecondarystructureelement.ResultsofRT-PCRsuggestedthatexpressionofK6geneisconstitutive.Expressionlevelsofthegeneinsoybeanyoungembryosdevelopmentalprocesswasrelativelyconstant.Moreover,expressionsofthegenewerealsodetectedinroots,hypocotylsandleaves.%为了解高温处理促进大豆幼胚萌发成苗的分子生物学机制,采用经典的基因表达差异显示技术，分析大豆品种日本晴高温处理的幼胚与对照组材料的差异表达基因.对其中一个差异表达基因K6进行了测序和比对分析，结果表明该基因序列与大豆Williams82基因组中的Lea5基因相似度高达99%,可以确定为Lea5基因.Blastp比对分析结果表明大豆Lea5蛋白为LEA-3亚家族成员.利用蛋白质分析软件分析了Lea5基因推测的蛋白质结构的特点,结果表明该蛋白质由113个氨基酸组成,相对分子量为12.283kD,等电点高达10.12.该蛋白质不形成典型的二级结构.RT-PCR分析表明该基因表达具有组成型特点，在大豆幼胚发育过程中稳定表达，在大豆的根、胚轴和叶片等器官中均有表达.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷)，期】2017(026)006【总页数】7页(P550-556)【关键词】大豆幼胚;高温处理;差异显示技术;Lea5基因;逆转录PCR【作者】何道一;周秀杰;张坤亮;夏仁杰【作者单位】淮北师范大学,生命科学学院,资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽淮北235000;淮北师范大学,生命科学学院,资源植物生物学安徽省重点实验室,安徽淮北235000;淮北师范大学,生命科学学院,资源植物生物学安徽省重点实验室,安徽淮北235000;淮北师范大学,生命科学学院,资源植物生物学安徽省重点实验室,安徽淮北235000【正文语种】中文【中图分类】Q946.1大豆是全球最重要的油料和经济作物之一，也是人类食品和动物饲料中植物性蛋白的主要来源［1,2］。大豆种胚成熟过程中发生的蛋白质的累积不仅与大豆产量和品质密切关联，也是大豆种子进一步萌发生长的物质基础。同时，大豆成熟种胚是蛋白质含量最丰富的生物组织之一，高蛋白品种中蛋白质含量高达50%以上，如此高的蛋白质积累并能保持蛋白质性质和功能的机制也是具有重要的理论和实践价值的研究对象。差异显示技术(DDRT)是在基因表达出现明显差异但表达产物不能确定情况下克隆差异表达基因的一种简单有效技术之一［3］。该技术利用锚定引物和随机引物的组合对mRNA逆转录产物进行扩增，经过不断的技术改良［4,5］，它已经成为一种成熟的基因克隆技术，广泛用于分析植物逆境抗性、生长发育等重要生命现象中基因的表达［6-12］。与现有其他基因克隆技术相比，该技术具有操作简单、快速，灵敏度高等优点，对实验装备不高的实验室特别适用。但该技术也存在明显的缺点，即假阳性高、重复性差，克隆的片段短等［13,14］。在大豆幼胚培养的实践中，我们偶然发现高温(37°C)是促进大豆幼胚萌发最好的诱因［15］。温度变化改变植物基因表达研究已被广泛证实，为探究高温处理促进大豆幼胚萌发的分子机制，我们对高温处理大豆幼胚和未高温处理的幼胚进行差异显示分析，获得有差异的条带53条，最终经过测序有明确产物序列的32个，K6(Lea5)即为其中一个差异表达的基因，本文就该基因的初步研究结果进行报道。试验的大豆品种为资源植物生物学安徽省重点实验室保存的日本晴，台湾292,徐豆9号。基因差异显示分析(DDRT)时，取日本晴的幼胚在37C、无光、100r/min条件下处理48h作为处理组，未作处理的作为对照。RT-PCR分析时试验材料为日本晴，台湾292，徐豆9号等三个品种的不同发育时期的幼胚、根、下胚轴及叶片。用Trizol法提取处理及对照大豆材料的总RNA。以变性胶电泳观察制备的RNA的完整性。用微量紫外分光光度计(NanoPhotometer,implen)测量样品中RNA的浓度。取约20pL的总RNA于1.5mL离心管中,加入10U的无RNase的DNaseI(TaKaRa公司)于50pL反应体系中37C水浴30min,经酚、氯仿抽提后,用乙醇沉淀总RNA，最后溶于20pLDEPC处理的无菌水中，纯化后的总RNA用于DDRT和RT-PCR分析。取5"纯化后的总RNA加入1pLOlig（T）弓物以及1pL逆转录酶（OmniscriptRTkit,qiagen），按照试剂手册的要求进行逆转录，合成cDNA第1链。cDNA的PCR扩增体系为：cDNA第1链反应产物2pL,10xBuffer5pL,2.5mmol/LdNTP5pL,25mmol/LMgCl210pL,锚定引物1pL,随机引物1pL,EX-Taq酶（TaKaRa公司）1pL,补加无菌水至终体积为50pL。扩增反应条件为：94°C2min,94°C30s,48°C50s,72°C3min,30个循环，72°C延伸10min,4°C保温。弓物由生工生物工程（上海）有限公司合成。弓物见表1,其中B0327和B0328为锚定引物。采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，1xTAE作为电泳缓冲液,100V恒电压下预电泳10min。然后将12pL的样品（样品中含有加入的载样液2pL）点样电泳。电泳完毕，取下胶片银染。去离子水漂洗2~3次，固定液（0.5%冰醋酸+10%乙醇）中固定6min，固定2次。染色液（0.2%AgNO3）中染色10min，去离子水中漂洗2~3次，每次5min，显色液（1.5%NaOH+0.4%甲醛）中显色15min。银染后的胶片用扫描仪进行扫描。将出现的差异条带进行编号并用干净小刀切取，并将胶块切碎，于1.5mL离心管中，用UNIQ-10柱式回收纯化试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）回收。取2pL回收产物作为二次PCR扩增的模板，用相同引物组合和反应体系进行扩增。扩增条件同1.3。扩增片段经琼脂糖电泳并切胶回收，再与pMD18-T载体连接，连接产物转化宿主菌DH5a,涂布在含100mg/L氨苄青霉素（Amp）和IPTG/X-gal的LB培养基平板上,37°C过夜培养，挑取白色菌落进行震荡培养,碱裂解法提取重组质粒,EcoRI和Hind山双酶切鉴定重组子。已鉴定的T-A克隆重组质粒经生工生物工程（上海）有限公司测序，所得序列通过NCBI（）在线进行Blastn比对分析。根据其核苷酸序列中存在的翻译匡推导出其蛋白质序列。对其推测的蛋白质序列用CLCProteinworkbench5软件分析和通过NCBI()在线进行Blastp比对分析。以大豆日本晴，台湾292，徐豆9号等三个品种根、胚轴和幼叶以及日本晴授粉后20d、25d和30d胚为材料制备总RNA，取2"经无RNase的DNaseI(TaKaRa公司)处理的总RNA用作RT-PCR模板，根据二步法RT-PCR试剂盒操作说明制备第一链cDNA。根据Lea5基因的序列设计上游引物EXF:ttcatcggcgaggttacgc和下游引物EXR:gatcggagcaacctatgcc。扩增循环条件为：94°C2min,94°C30s,50°C50s,72°C3min,30个循环，72°C延伸10min，以大豆Ubiquitin-1基因作参照，扩增Ubiquitin-1基因的引物为UB1:gtcaaggctaagattcagg和UB2:agggtgattccttctggt，扩增循环条件为：94°C2min,94°C30s,48°C50s,72°C3min,30个循环，72°C延伸10min。用经典的差异显示分析方法(DDRT)分析对照组的和高温处理组材料的基因转录水平的差异，部分结果见图1。与对照组相比，高温处理组扩增出的带型有一定的变化。在引物B0313和B0327扩增的产物中，高温处理组中有4条带是对照组中没有或转录量低的，按分子量由小到大分别命名为K3、K4、K5和K6。将差异的条带切胶回收，再经一轮PCR扩增，扩增产物回收后与pMD-18T载体连接并转化大肠杆菌，重新提取质粒，进行核酸序列测定。其中K6的核酸序列为：GAACAACAACACAAGGTTACCCTACCAAACCAAACCAAACCAAACCAAATCCTAAGTAAAATTTGGGCATGTCATGGGTGTCCGGCAACTCCTCTAGGCTCTAGTGGAGGTGATCGGAGCAACCTATGCCGAAGCTCCACCGGGTCAATTTCAGGGGTGTGGTTAATGGGCCTATAGTAACCTGTTACTGGGTCTGGGGCCCAATCAGTTGAGTAGGCTTTTGAACCATCTCTTGTATCAGGCTTCTCTTCTACACCTCCCACGATTCCATTCCTTCGCCCAATATTACCCAATCCAACTCTTACCGATACATCGGATGCCACTGCGTAACCTCGCCGATGAACGGGAATTAGGGAGATAGATTGAGCAACAAGGACACCAATACGTTTGGCTTGCGAGAGAGAACGGGCCATCTTATTATATGATATGAGTAATTTGTTAGTTTGCTG将K6的核酸序列通过NCBI()进行Blastn比对分析，结果见图2。其与大豆Lea5基因(gb|U66316.1|GMU66316)449个核苷酸中只有3个存在差异，其相似性高达99%。因此可以认定K6为大豆Lea5基因，其逆向互补序列为该基因的转录产物。根据克隆的大豆Lea5基因序列，大豆Lea5蛋白的推测氨基酸序列为：MARSLSQAKRIGVLVAQSISLIPVHRRGYAVASDVSVRVGLGNIGRRNGIVGGVEEKPDTRDGSKAYSTDWAPDPVTGYYRPINHTPEIDPVELRHRLLRSPPLEPRGVAGHP。将该氨基酸序列NCBI()进行Blastp比对分析，大豆Lea5蛋白为LEA-3亚家族成员，其功能目前还不清楚。CLCProteinworkbench5软件分析结果显示，该蛋白质由113个氨基酸残基组成，相对分子量为12.283kD，等电点为10.12，脂肪族氨基酸指数为89.646。该蛋白质不形成典型的二级结构。采用RT-PCR半定量分析法分别对大豆根、胚轴和叶片中Lea5基因表达情况进行分析，结果见图3，表明Lea5基因这三种器官中均有表达，而且表达的量大体相当。同样，对Lea5基因在大豆的20d、25d和30d胚中表达情况进行分析(见图4)，结果表明Lea5基因在这三个时期胚中有表达，且表达量也没有大的差异。LEA蛋白被称为胚胎发育晚期丰富蛋白，是广泛存在生物细胞中一个蛋白质家族［16］。LEA蛋白最早被发现于小麦和棉花种子胚胎晚期［17,18］，目前，越来越多的LEA蛋白家族成员被发现［19-22］。通常认为LEA蛋白与细胞逆境抗性有关［23,24］，特别与失水抗性有密切关系［25］，同时也发现LEA蛋白具有蛋白质分子伴侣作用［26］，但随研究的深入，LEA蛋白的功能越来越难以确定，该蛋白与热休克蛋白被认为是迷一样的蛋白［27］，LEA蛋白家族成员任何环节的研究成果对该类蛋白质功能的认识都具有理论意义。李乐等利用生物信息学的方法对大豆基因组数据库进行分析［28］，从中找到了36个Lea基因，该基因组数据是大豆品种William8基因组测序的结果。利用差异显示技术实验方法我们从日本晴大豆品种中也克隆到Lea5基因，所克隆的Lea5基因与李乐等［28］分析的GmLEA15（基因序列号Glyma17g03040）是同一个基因，但有三个核苷酸不同，其中一个核苷酸出现在5'端不翻译区，二个核苷酸出现在编码区，蛋白质的一级结构没有改变。该蛋白质等电点为10.12，中性pH值条件下该蛋白质带正电荷。该蛋白质没有典型的二级结构，具有蛋白质分子伴侣的特征。植物中的Lea5基因通常被认为是诱导表达的。植物在受到环境胁迫，如干旱、高温、盐渍等非生物逆境胁迫Lea基因表达量显著增加［29,30］。我们对Lea5基因的表达进行了初步分析，结果表明该基因的表达几乎为组成型表达，在种子发育进程中表达量并未发生显著变化。这与大多数Lea基因的表达显著不同。李乐等［28］利用生物信息学工具对GmLEA15基因表达进行预测分析，认为该基因在种子中表达量较大，根、叶片和花等器官表达量小。但我们的实验结果表明Lea5基因在根、叶片和胚轴等器官都有表达，而且表达量与胚中的没有很大的差异，这些结果—方面说明生物信息软件分析与实验分析的结果存在着差异，另一方面也说明我们所克隆到的Lea5基因与一般的Lea基因具有明显不同特点。目前，我们已经将所克隆到的Lea5基因构建了过表达载体转化烟草进行过表达分析，下一步还将构建其RNAi干扰载体转化大豆，进行基因敲除分析。【相关文献】王丕武,张君,姚丹,等.高产中熟春大豆新品种"吉农17号’选育报告[J].吉林农业大学学报,2007,29(1):15-17.WANGPiwu,ZHANGJun,YAODan,etal.AbreedingreportonthenewsoybeanvarietyofJinong17[J].JournalofJilinAgriculturalUniversity,2007,29(1):15-17.程琳静，闫军辉，钟云鹏,等.大豆高效体细胞胚诱导和增殖方法的研究[J].大豆科学,2014,33(3):305-310.CHENGLinjing,YANJunhui,ZHONGYunpeng,etal.Resarchtotheeffectivemethodsofsoybeansomaticembryoinductionandproliferation[J].SoybeanScience,2014,33(3):305-310.LIANGP,PARDEEAB.Recentadvancesindifferentialdisplay[J].CurrentOpinionImmunology,1995,7(2):274-280.TUGORESLB,LEDESMAJ.DifferentialdisplayofeukaryoticmRNA[J].MethodsinMolecularBiology,1999,97(461):575-590.LIEVENSS,GOORMACHTIGS,HOLSTERSMA.Criticalevaluationofdifferentialdisplayasatooltoidentifygenesinvolvedinlegumenodulation:Lookingbackandlookingforward[J].NucleicAcidsResearch,2001,29(17):3459-3468.刘凯,曾继吾,夏瑞,等.柑橘mRNA差异显示技术体系建立[J].基因组学与应用生物学,2009,28(2):339-344.LIUKai,ZENGJiwu,XIARui,etal.EstablishingthesystemofCitrusmRNAdifferentialdisplaytechnology[J].GenomicsandAppliedBiology,2009,28(2):339-344.衡伟,程秀云,贾兵,等.mRNA差异显示法筛选‘砀山酥梨’褐皮芽变相关差异表达基因[J].中国农业科学,2013,46(15):3172-3179.HENGWei,CHENGXiuyun,JIABing,etal.Differentialexpressiongenesof‘Dangshansuli’pearrussetmutantscreenedwithDDRT-PCR[J].ScientiaAgriculturaSinica,2013,46(15):3172-3179.LANGP,ZHANGCK，EBELRC,etal.IdentificationofcoldacclimatedgenesinleavesofcitrusunshiubymRNAdifferentialdisplay[J].Gene,2005,359:111-118.吴海波，郑国华,牛先前，等.DDRT-PCR技术分离枇杷幼果低温诱导相关基因[J].热带作物学报,2010,31(3):416-421.WUHaibo,ZHENGGuohua,NIUXianqian,etal.IsolationofcoldstressgenesinloquatfruitbyDDRT-PCRtechnique[J].ChineseJournalofTropicalCrops,2010,31(3):416-421.王楠,尹俊奇，周莹，等.大豆花芽mRNA差异显示技术体系反应条件的优化[J].吉林农业大学学报2013,35(4):389-392,397.WANGNan,YINJunqi,ZHOUYing,etal.Optimizationofthesystemofsoybeanflowerbuddifferentialdisplaytechnology[J].JournalofJilinAgriculturalUniversity,2013,35(4):389-392,397.杨转英，胡桂兵，王惠聪,等.不同着色期荔枝果皮总RNA的提取及mRNA差显分析[J].果树学报,2008,25(2):281-285.YANGZhuanyin,HUGuibing,WANGHuicong,etal.TotalRNAextractionandmRNAdifferentialdisplayanalysisoflitchipericarpsatdifferentcoloringstages[J].JournalofFruitScience,2008,25(2):281-285.叶楠，李永刚，文景芝.利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)研究大豆抗疫霉根腐病的分子机制[J].东北农业大学学报，2008,39(9):6-9.YENan,LIYonggang,WENJingzhi.ResearchonmolecularmachanismsofsoybeanresistancetoPhytophthorasojaebymRNAdifferentialdisplayPCR[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity,2008,39(9):6-9.PARDINASJR,CONMBATESNJ,PROUTYSM,etal.Differentialsubtractiondisplay:aunifiedapproachforisolationofcDNAsfromdifferentiallyexpressedgenes[J].AnalyticalBiochemistry,1998,257(2):161-168.VOGELI-LANGER.RapidselectionandclassificationofpositiveclonesgeneratedbymRNAdifferentialdisplay[J].NucleicAcidsResearch,1996,24(7):1385-1386.何道一，张艳梅，张坤亮，大豆幼胚培养直接成苗影响因素研究[J].大豆科学，2012,31(1):34-37.HEDaoyi,ZHANGYanmei,ZHANGKunliang.Influencefactorsofplantletregenerationdirectlyfromculturedyoungembryosinsoybean[J].SoybeanScience,2012,31(1):34-37.GALAUGA,HUGHESDW,DURELIII.Abscisicacidinductionofclonedcottonlateembryogenesis-abundant(Lea)mRNAs[J].PlantMolecularBiology，1986,7(3):155-170.DURELIII,GREENWAYSC,GALAUGA.Developmentalbiochemistryofcottonseedembryogenesisandgermination-changingmessengerribonucleicacidpopulationsasshownbyinvitroandinvivoproteinsynthesis[J].Biochemistry,1981,20(14):4162-4168.GRZELCZAKZF,SATTOLOMH,HANLEY-BOWDOINLK,etal.SynthesisandturnoverofproteinsandmessengerRNAingerminatingwheatembryos[J].CanadianJournalofBiochemistry,1982,60(3):389-397.ROBERTSJK,DESIMONENA,LINGLEWL,etal.Cellularconcentrationsanduniformityofcell-typeaccumulationoftwoLEAproteinsincottonembryos[J].PlantCell,1993,5(7):769-780.BROWNEJ,TUNNACLIFFEA,BURNELLA.Plantdesiccationgenefoundinanematode[J].Nature,2002,416(6876):38.SALESK,BRANDTW,RUMBAKE,etal.TheLEA-likeproteinHSP12inSaccharomycescerevisiaehasaplasmamem-branelocationandprotectsmembranesagainstdesiccationandethanol-induc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