第三章细胞生物学研究方法(4学时)

细胞生物学研究方法进行初步观察形成可验证的假说设计试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识生物学研究模式生物是基于不同物种享有共同分子机制目前一页\总数四十六页\编于十六点CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana目前二页\总数四十六页\编于十六点第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术目前三页\总数四十六页\编于十六点第一节细胞形态结构的观察方法

1光学显微镜技术（lightmicroscopy）

2

电子显微镜技术

(Electromicroscopy)3扫描遂道显微镜

(scanningtunnelingmicroscope)目前四页\总数四十六页\编于十六点一、光学显微镜技术（lightmicroscopy)

普通复式光学显微镜技术

荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦扫描显微镜技术（LaserScanningConfocalMicroscopy）

相差显微镜（phase-contrastmicroscope）（自习）目前五页\总数四十六页\编于十六点普通复式光学显微镜技术

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离目前六页\总数四十六页\编于十六点普通光学显微镜目前七页\总数四十六页\编于十六点各种显微镜的分辨率梯度目前八页\总数四十六页\编于十六点荧光显微镜技术

（FluorescenceMicroscopy）原理目前九页\总数四十六页\编于十六点荧光显微镜技术

（FluorescenceMicroscopy）应用

直接荧光标记技术

间接荧光标记技术(免疫荧光标记技术)

用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用

目前十页\总数四十六页\编于十六点应用：绿色荧光蛋白目前十一页\总数四十六页\编于十六点激光共焦扫描显微镜技术

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：应用： 排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，通过“光切片”观察样品内部结构，可重构样品的三维结构。目前十二页\总数四十六页\编于十六点激光共焦扫描显微系统(Confocal

System)目前十三页\总数四十六页\编于十六点PineTreepollen-collectedonaBio-RadMRC1024atPurdueUniversityCytometryLaboratories

利用光切片技术显示的花粉内部结构目前十四页\总数四十六页\编于十六点1为转GFP基因的烟草单细胞；2为转SCaM1-GFP融合基因的烟草单细胞；3为转SCaM4-GFP融合基因的烟草单细胞。

质壁分离后转基因烟草单细胞的激光共聚焦显微镜观察细胞壁细胞膜细胞核细胞壁细胞壁细胞膜细胞核细胞膜细胞核细胞核细胞膜细胞壁细胞核细胞膜目前十五页\总数四十六页\编于十六点二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较

电子显微镜的基本构造

目前十六页\总数四十六页\编于十六点电镜与光镜的比较

显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差目前十七页\总数四十六页\编于十六点电子显微镜的基本构造电子束照明系统、成像系统、真空系统、记录系统目前十八页\总数四十六页\编于十六点二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较

电子显微镜的基本构造

主要电镜制样技术

负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术

目前十九页\总数四十六页\编于十六点主要电镜制样技术超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图细胞超微结构

负染色技术（Negativestaining）

染色背景，衬托出样品的精细结构，如病毒、核糖体等结构。

冷冻蚀刻技术（Freezeetching）

冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。

电镜三维重构技术

电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）

主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。

目前二十页\总数四十六页\编于十六点固定

包埋切片染色超薄切片技术目前二十一页\总数四十六页\编于十六点超薄切片技术图片示例目前二十二页\总数四十六页\编于十六点冷冻蚀刻目前二十三页\总数四十六页\编于十六点二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造

主要电镜制样技术

负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术

扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）

目前二十四页\总数四十六页\编于十六点扫描电镜原理与应用：

电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。

CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题目前二十五页\总数四十六页\编于十六点目前二十六页\总数四十六页\编于十六点三、扫描遂道显微镜ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器。反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。特点：分辨率高：

侧分辨率：分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.001nm不受介质限制非破坏性

用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构，观察生物大分子、膜、病毒等的结构。目前二十七页\总数四十六页\编于十六点

2.特异蛋白抗原的定位与定性

3.细胞内特异核酸的定位与定性

4.放射自显影技术

1.离心分离技术第二节细胞组分的分析方法目前二十八页\总数四十六页\编于十六点一、离心分离技术

用途：分离细胞器与生物大分子及其复合物

差速离心：分离密度不同的细胞组分

密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离目前二十九页\总数四十六页\编于十六点差速离心目前三十页\总数四十六页\编于十六点密度梯度离心常用的介质：蔗糖、氯化铯、甘油等。目前三十一页\总数四十六页\编于十六点二、特异蛋白抗原的定位与定性

免疫荧光技术

快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限免疫电镜技术免疫胶体金技术应用：能对蛋白进行精细定位。如通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。蛋白电泳(SDS)与免疫印迹反应(Western-Blot)目前三十二页\总数四十六页\编于十六点免疫荧光技术图片示例目前三十三页\总数四十六页\编于十六点免疫胶体金技术原理与图片示例目前三十四页\总数四十六页\编于十六点三、细胞内特异核酸的定位与定性

光镜水平的原位杂交技术

（同位素标记或荧光素标记的探针）

电镜水平的原位杂交技术

（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）

目前三十五页\总数四十六页\编于十六点四、放射自显影技术原理及应用：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。

目前三十六页\总数四十六页\编于十六点目前三十七页\总数四十六页\编于十六点第三节细胞培养、细胞工程

1细胞的培养2细胞工程与显微操作技术目前三十八页\总数四十六页\编于十六点一、细胞的培养

动物细胞培养 类型：原代培养细胞（primaryculturecell） 传代培养细胞（sub-culturecell）

细胞株（cellstrain）正常二倍体，具有接触抑制。

细胞系（cellline）染色体改变，接触抑制丧失，无限传代植物细胞培养非细胞体系（cell-freesystem）

研究DNA复制、蛋白质合成等生命活动目前三十九页\总数四十六页\编于十六点目前四十页\总数四十六页\编于十六点Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养目前四十一页\总数四十六页\编于十六点二、细胞工程细胞融合（cellfusion）与细胞杂交（cellhybridization）技术单克隆抗体技术细胞拆合与显微镜操作技术转基因动物与转基因植物