移植免疫及其免疫检测

移植免疫及其免疫检测第一页，共73页。

移植（transplantation）是指将健康细胞、组织或器官从其原部位移植到自体或异体的一定部位、用以替代或补偿机体所丧失的结构和（或）功能的现代医疗手段。被移植的细胞、组织或器官称移植物（graft），提供移植物的个体称为供体(donor)，接受移植物的个体称为受体（recipient）。

第二页，共73页。

自体移植同系移植同种异体移植异种移植原位移植根据移植部位分类异位移植器官移植

移植物种类分类支架组织移植细胞移植根据移植物来源分类移植的类型第三页，共73页。

移植名称 供者、受者关系 举例

自体移植

同一个体

自体皮片移植

同系或同基因移植同系或同基因人的单卵双生子间的器官移植的个体间同品系小鼠的皮片移植同种异基因移植同种不同基因人与人之间的肾移植的个体间不同品系小鼠间的皮片移植异种移植异种动物间 狗的器官移植给猩猩猪的器官移植给狗移植种类和命名

第四页，共73页。第一节器官移植与移植免疫的特点移植手术后移植物能否存活取决于：1.移植器官在移植过程中活力的保存；2.手术时血管吻合和血液循环重建的质量；3.移植排斥反应的控制。第五页，共73页。一、器官和组织移植的一般规律1.移植器官或组织的抗原性异物属性2.排斥移植物的记忆特性3.负向免疫调节的必要性第六页，共73页。二、HLA是诱导排斥反应最强的靶抗原主要组织相容性复合体（majorhistocompatibilitycomplex,MHC）编码的人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen,HLA），是不同个体间进行器官或组织细胞移植时发生排斥反应的主要成分，这种代表个体特异性的同种抗原又称组织相容性抗原(histocompatibility)或移植抗原(transplantationantigen)。第七页，共73页。

HLA是人体多态性最丰富的基因系统。HLA的遗传特征第八页，共73页。HLA分型要比ABO血型复杂的多，每个人不是从父母分别得到一个基因，而是得到一串基因(HLA单倍型)。每人遗传到二串“冰糖葫芦，其上的“红果”(基因)以A、B、C、D、DR、DQ和DP为序。A有28种红果(分别记为A1、、A2、A3、A9...)，B有61种(记为B5、B7、B8、B12...)，DR有24种(记为DR1、DR2、DR3、DR4...)等。七彩红果共有164种编号，如不同遗传排列的红果随机组合，按理论推算，“冰糖葫芦”有五亿多种变化，能组合33亿多种HLA分型。理论推测的HLA分型数量巨大，但对一个具体的民族来说并非如此。第九页，共73页。在三类HLA分子中，Ⅰ、Ⅱ类分子是触发移植排斥反应的首要抗原，尤其是HLA-DR位点的抗原分子HLA的识别方式：直接识别间接识别HLA发挥双重作用：介导宿主抗移植物反应(HVGR);参与移植物抗宿主反应(GVHR)。第十页，共73页。第二节

HLA配型与应用分析HLA分型方法的改进和不断完善，使得HLA复杂的多态性更加显现，亦推动了HLA与群体及自然选择关系的研究，更促进了人们对疾病本质的认识。一、HLA配型第十一页，共73页。（一）血清学分型法

应用一系列已知抗HLA的特异性标准分型血清与待测淋巴细胞混合，借助补体的生物学作用介导细胞裂解的细胞毒试验。耗时长不同批号抗血清结果常有不同

操作简便易行节约试剂、结果可靠、重复性好无需特殊设备

优点缺点第十二页，共73页。用于HLA分型的微量细胞毒试验第十三页，共73页。死（着染）细胞（%）记分结果判断0～101阴性11～202可疑阴性21～504弱阳性51～806阳性>808强阳性0未试验或不能读数微量细胞毒试验判定标准第十四页，共73页。（二）细胞学分型法

以混合淋巴细胞培养（mixedlymphocyteculture,MLC）或称混合淋巴细胞反应（mixedlymphocytereaction,MLR）为基本技术的HLA分型法。能用本法测定的抗原称为LD抗原（lymphocytedefinedantigen）,包括HLA-D、-DP。MLC分为单向MLC和双向MLC第十五页，共73页。

将已知HLA型别的分型细胞用丝裂霉素C或X线照射预处理，使其失去增殖能力仅作为刺激细胞；而以具有增殖能力的受检者外周血单个核细胞为反应细胞。两者混合培养时，反应细胞可对刺激细胞发生应答而增殖，用3H-TdR掺入法测定细胞增殖强度，从而判断受检细胞的HLA型别。根据选用的刺激细胞类型分为：1．阴性分型法

2．阳性分型法1.单向MLC第十六页，共73页。

遗传型不同的两个个体淋巴细胞在体外混合培养时，由于两者HLA不同，能相互刺激导致对方淋巴细胞增殖，故称双向MLC。在此试验中，各自的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞，反应后形态上呈现的细胞转化和分裂现象，可通过形态法计数转化细胞。2.双向MLC本法不能判断型别，只能说明供、受体HLA抗原配合程度第十七页，共73页。（三）分子生物学分型法

分子生物学技术的迅速发展，使得HLA的DNA分型技术应运而生，并在开展DNA限制性片段长度多态性分析、DNA指纹图、等位基因特异性寡核苷酸杂交等基础上，引入多聚酶链反应技术，使HLA分型得以在更精密的水平上进行。第十八页，共73页。限制性片断长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析：最早建立的研究HLA多态性的DNA分型技术

PCR-RFLP分型法：对DNA片段进行体外扩增，然后再用限制性内切酶进行酶切分析，可使限制性长度分析的敏感度大大增加1.RFLP与PCR-RFLP分型法

第十九页，共73页。第二十页，共73页。序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应（PCR-sequencespecificoligonucleotide,PCR-SSO）是以PCR为基础，将凝胶上扩增的HLA基因DNA转移至硝酸纤维膜或尼龙膜，进而用放射性核素或酶、地高辛等非放射性物质标记的寡核苷酸探针与之进行杂交，从而对扩增产物作出HLA型别判断。

2.PCR-SSO分型法

第二十一页，共73页。分类：斑点或印渍法反向斑点或印渍法PCR-SSO是Ⅱ类HLA分型应用最广泛的方法，能够鉴定所有已知序列的HLA-DR、－DQ、－DP等位基因第二十二页，共73页。是近年发展起来的一项新技术,将其与PCR-SSO结合应用于HLA分型，可使分型趋于规模化和自动化，尤其在HLA多态性和疾病遗传背景分析等方面更具优势。HLA的基因芯片分型法，实际上是PCR-SSO反向斑点或印渍法的微型化。目前，基因芯片在HLA分型领域的应用尚属起步阶段。基因芯片(genechip)第二十三页，共73页。第二十四页，共73页。原理：应用设计的一套HLA等位基因的序列特异性引物（sequencespecificprimer,SSP）,对待测DNA进行PCR扩增，从而获得HLA型别特异性的扩增产物3.PCR-SSP分型法

HLA基因扩增的特异性包括：座位特异性（locus-specific），如HLA-A、－B、-DRB1等；组特异性（group-specific），如DRB1-01、DRB1-02等；等位基因特异性（allele-specific），如DRB1*0401、DRB1*0402等。第二十五页，共73页。

4.PCR-SSCP分型法

单链构象特异性－聚合酶链反应（PCR-singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP）是以待测基因PCR扩增为基础，对扩增的单链DNA（ssDNA）的HLA分型方法。第二十六页，共73页。原理：对ssDNA进行无变性剂的聚丙烯酰凝胶电泳时，因其序列的差异可形成不同的空间构象而导致电泳迁移率的差异，如此可分辨出单一碱基的差异和检测出DNA多态性或点突变，有助于新的HLA等位基因或突变体的发现。

4.PCR-SSCP分型法

特点：PCR-SSCP作为PCR-SSO的补充，在区分纯合子和杂合子基因方面有其独到之处，有利于排除SSO杂交的假性。第二十七页，共73页。基本过程：分离待测细胞的DNA，应用座位、组或等位基因特异性引物进行PCR扩增，扩增产物的纯化和测序，测出的基因序列与HLA基因库的DNA已知序列比较，判断待测的HLA型别。

5.SBT分型法

基于序列的HLA分型法（sequence-basedHLAtyping,SBT），通过对扩增后的HLA基因片段通过核酸序列测定来判断HLA型别。第二十八页，共73页。二、HLA分型方法的应用（一）HLA配型（二）HLA交叉配型与预存抗体的检测（三）

群体性反应抗体（PRA）的检测第二十九页，共73页。（一）HLA配型

HLA-A、HLA-B、HLA-C抗原和HLA-DQ、DR抗原采用补体依赖的微量细胞毒试验检测，HLA-D、HLA-DP等抗原采用混合淋巴细胞培养法测定。近年来，HLA基因分型技术的应用，使得配型更加精确和敏感。

第三十页，共73页。（二）HLA交叉配型与预存抗体的检测

移植前如果受者血清中预先存在抗供者淋巴细胞的细胞毒性抗体，移植后80%发生超急性排斥反应，因此必须做HLA交叉配型以检测受者体内抗供者淋巴细胞的细胞毒性抗体。

1.淋巴细胞交叉配合试验：检测受者是否有抗供者的特异性抗体，LD抗原的相容程度如何。细胞毒性>10%，则说明受者体内已存在细胞毒性抗体，应另选供者；若小于10%，表明供受者相配。第三十一页，共73页。

2.还可进一步作T、B细胞淋巴细胞毒性交叉配型。T细胞交叉配型阳性视为移植的禁忌证。B细胞交叉配型对于弱Ⅰ类抗体更敏感。

3.流式细胞法交叉配型，供者淋巴细胞与受者血清反应，与荧光标记的抗人IgG或其F（ab）2共育，用流式细胞仪检测。

4.自身交叉配型：受者血清和受者细胞进行细胞毒试验，若阳性可致与供者的交叉配型出现假阳性。第三十二页，共73页。纵上所述，交叉配型阳性表明受者预存抗供体的抗体。作受体选择时：组织配型差，交叉配型阴性，仍可移植。组织配型好，交叉配型阳性，不宜移植。交叉配型常用于肾移植，而不用于心、肝、肺等。第三十三页，共73页。（三）群体反应性抗体（panelreactiveantibodies,PRA）是指群体反应性抗HLA-IgG抗体，是各种组织器官移植术前筛选致敏受者的重要指标，与移植排斥反应和存活率密切相关。如果病人在曾经的输血或者器官移植中接触过他人HLA（人类白细胞抗原），则会产生较强的抗性，不利于器官移植配型。第三十四页，共73页。第三节

常见的组织或器官移植

临床器官移植术的建立至今已有50多年的历史。从肾脏移植到心肺移植、肝脏移植；从完整的器官移植到部分组织器官甚至是细胞移植；从单一的器官移植到器官联合移植。第三十五页，共73页。一、肾脏移植

肾脏移植，创始于1950年，是临床开展最早、应用最多和效果最佳的一种器官移植。由于免疫抑制药物的不断更新和移植技术的不断提高，肾脏移植患者1年和5年的存活率，分别可达90%

～95%和80%～90%。

第三十六页，共73页。组织配型是肾脏移植前选择供者的重要手段包括：ABO血型配型

HLA配型交叉配型肾源选择的原则：以ABO血型完全相同者为好，至少能够相容选择最佳HLA配型的供者器官1.肾脏移植对组织配型的要求第三十七页，共73页。临床观测项目:

T细胞总数、CD4/CD8比值和IL-2及其受体的检测，

判断排斥反应的发生和评估免疫抑制剂治疗效果肾组织活检，预测排斥反应的发生

RIA或者HPLC血药浓度检测，指导合理用药，减

少肾毒性

2.肾移植受者的疗效检测疗效监测：受者免疫状态检测第三十八页，共73页。二、肝脏移植

肝脏移植手术已经成为治疗原发性胆道闭锁、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、肝炎后肝硬化、酒精性肝病、肝细胞性肝癌、自身免疫性肝病、急性肝功能衰竭以及药物诱导的肝脏损伤等疾病，挽救晚期肝病患者生命的最有效方法。第三十九页，共73页。特点：

HLA是否匹配与肝脏移植效果无显著差异机制：肝脏移植后可出现天然或自发性免疫耐受现象，也称“移植肝脏免疫特惠现象”，因HLA不配仅发生较弱的排斥反应，而免疫抑制剂的应用有效控制了排斥反应的发生，仅注重ABO血型的配合。肝脏移植时仍应尽可能进行HLA配型1.肝脏移植对组织配型的要求第四十页，共73页。排斥反应发生几率：约2/3的肝移植患者出现过排斥反应的病理学改变，也有8％的病例术后发生急、慢性排斥反应，占肝移植致死原因的10%。2.肝移植受者的疗效检测组织病理学特点：肝移植术后第2天，汇管区出现明显的白细胞浸润，汇管区和肝窦的白细胞浸润第7天达高峰，涉及到T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜酸性和中性粒细胞。在浸润的T细胞中CD8+细胞高于CD4+细胞，也见有IL-2R和CD25+的活化T细胞。第四十一页，共73页。三、心脏移植与心肺联合移植

在世界范围内，约有300多个心脏中心进行心脏移植，总例数已超过7万，年病例不下3000，1年和5年存活率分别为80%和70%。心肺联合移植已成为人们可以接受的治疗终末期心肺疾病的一种有效方法。第四十二页，共73页。ABO血型匹配：避免急性排斥反应的首要条件。HLAI、Ⅱ类分子匹配：移植器官长期存活的重要因素。

淋巴细胞毒交叉配合和群体反应性抗体检测1.心脏和心肺联合移植对组织配型的要求第四十三页，共73页。

外周血淋巴细胞总数

T、B细胞的转化能力

T细胞亚类百分数及比值

CTL细胞毒作用细胞因子及其受体表达或转录水平转化生长因子

NK细胞数及其介导的自然杀伤或ADCC效应粘附分子及其配体在各类细胞表达情况2.心脏及心肺联合移植受者的疗效检测免疫监测指标第四十四页，共73页。

骨髓和干细胞移植均系非实质性器官移植，其中骨髓移植开展的较早，而干细胞移植正日益受到临床工作者的重视。四、骨髓与其他来源的干细胞移植第四十五页，共73页。特点：可同时发生HVGR和GVHR

分类：

自体骨髓移植同基因骨髓移植同种异基因骨髓移植（多见）

病例较少成功率高

骨髓移植实际上是造血干细胞移植，因此，骨髓中造血干细胞的质和量对移植的成败致关重要。1.骨髓移植第四十六页，共73页。方法：使用药物动员剂促使造血干细胞从骨髓释放到外周血，从中获取足量的干细胞用于移植，可获得与骨髓移植同样的治疗目的特点：与骨髓移植相比，具有采集方便、供者不需麻醉、移植后造血恢复快，GVHR发生率和严重程度不高等优点。

移植前检测：HLA和ABO血型配型、血常规与骨髓检验、性染色体测定、造血干细胞鉴定和GVHR征象追踪等肿瘤干细胞的发现，提示人们在进行干细胞应用时应该注意生物安全性。2.外周血和脐血干细胞移植第四十七页，共73页。第四节排斥反应的种类及发生机制移植排斥反应（tranlplantationrefection）是针对移植抗原产生免疫应答，从而导致移植物功能丧失或受者机体损害的过程。

第四十八页，共73页。排斥反应分类：超急性排斥反应急性排斥反应慢性排斥反应第四十九页，共73页。预防措施：ABO血型配型、交叉配型一、超急性排斥反应发生机制：受者体内存有抗供者移植物的预存抗体，与抗原结合，激活补体和凝血系统,导致血管内凝血。预存抗体来源：1、供受者之间ABO血型不合；

2、受者反复多次输血、妊娠或既往作过移植处理措施：立即移除移植物发生时间：血循环恢复后的数分钟至1～2天内第五十页，共73页。分类：急性体液性排斥反应：抗体激活补体，并有CD4+T细

胞参与，导致急性血管炎急性细胞性排斥反应：CD8+CTL细胞的细胞毒作用、CD4+T和巨噬细胞的作用，导致急性间质炎。二、急性排斥反应发生时间：移植后数周至数月内，是排斥反应最常见的类型处理措施：使用免疫抑制剂第五十一页，共73页。①直接途径（directpath）:残留于供者移植物内的抗原提呈细胞（过客细胞）对受者机体的免疫系统提供最初的抗原刺激。这种抗原性刺激，来自移植物中树突状细胞和单核细胞等表面富含的HLA-Ⅰ、-Ⅱ类分子②间接途径（indirectpath）:通过受者体内的抗原提呈细胞对具有同种异基因HLA-Ⅰ、-Ⅱ类分子的移植物实质细胞的识别。无论是供者还是受者，其抗原提呈细胞提供的IL-1、IL-6等刺激信号，有助于触发淋巴细胞的活化急性排斥反应中的两条抗原提呈途径第五十二页，共73页。同种移植排斥反应的发生机制第五十三页，共73页。三、慢性排斥反应发生时间：一般发生于移植后数月甚至数年临床特征：对免疫抑制疗法不敏感无特异性治疗方法最终需要重新进行器官移植病理特点：血管壁细胞浸润、间质纤维化和瘢痕形成第五十四页，共73页。T细胞、巨噬细胞等介导的迟发型超敏反应等免疫损伤。B细胞产生的抗体活化补体或通过ADCC破坏血管内皮细胞。急性排斥反应反复发作所导致的移植物组织退行性变，此与细胞和体液免疫均有关系。非免疫相关因素，诸如局部缺血、再灌注损伤、微生物感染等。受者患有高血压或糖尿病也可促使慢性排斥反应的发生引起慢性排斥反应的因素第五十五页，共73页。定义：在骨髓移植时，供者骨髓中的免疫细胞启动以受者细胞为靶抗原的免疫应答反应，引起攻击受者的移植物抗宿主反应。GVHD也可见于脾、胸腺和小肠移植。四、移植物抗宿主反应发生机制：T细胞起主要作用

IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ等细胞因子参与

ICAM、VCAM、CD44、ELAM-1等粘附分子参与第五十六页，共73页。第五节排斥反应的免疫监测

排斥反应发生时，受者体内的免疫应答将发生一系列变化，据此，检测机体的免疫状态可帮助诊断或推测排斥反应的发生。第五十七页，共73页。一、体液免疫与细胞免疫水平检测的临床意义特异性抗体水平的检测

相关免疫指标：

ABO等血型和HLA抗体抗供者组织细胞抗体血管内皮细胞抗体冷凝集素测定方法:

交叉配型、补体依赖的细胞毒性试验血清PRA水平:判断器官移植时受体对移植物的敏感程度，基于细胞毒性试验的PRA测定，被作为心脏移植前的常规项目，若PRA超过5％，则应进行供者淋巴细胞与受者血清的交叉配型。（一）体液免疫水平检测的临床意义第五十八页，共73页。补体水平的检测补体活性与急性移植排斥反应的发生有关当移植物遭受排斥时，补体成分的消耗增加可采用溶血法或比浊法进行检测。补体活性的检测补体的裂解产物，如C3a、C3b等的测定常用的检测方法有免疫电泳、免疫标记技术第五十九页，共73页。（二）细胞免疫水平检测的临床意义外周血T细胞及其亚类的计数

CD4/CD8比值大于1.20时:预示急性排斥即将发生，

CD4/CD8比值小于1.08时:发生感染的可能性很大。若进行动态监测，对急性排斥反应和感染具有鉴别诊断的意义NK细胞活性测定混合淋巴细胞反应:刺激细胞:灭活的供者的淋巴细胞反应细胞:受者淋巴细胞结果显示的是CTL和NK细胞共同作用的结果。动态监测NK细胞活性则意义更大第六十页，共73页。血清细胞细胞因子测定

IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ等细胞因子的水平均可升高

个体间血清IL-2R的含量差别显著比较受者接受移植物前后的细胞因子水平环孢霉素A具有肾毒性，血清肌酐值增高，而IL-2R却明显降低血清肌酐值和IL-2R同时增高提示急性排斥反应的发生巨细胞病毒感染时，IL-2R血清含量的升高将更为明显第六十一页，共73页。粘附分子及其配体的检测免疫细胞以及血管内皮细胞等细胞膜表面粘附分子及其配体的表达，与急性排斥反应的发生密切相关。诸如ELAM-1、VCAM、ICAM和HLA分子等第六十二页，共73页。二、尿微量蛋白检测的临床意义

尿微量蛋白检测意义：

判断大器官移植、尤其是肾脏移植时排斥反应的发生检测免疫抑制药的肝肾毒副作用

α1-微球蛋白是能较早反映肾功能损害的指标尿α-1微球蛋白和尿IgG与肾移植受者短期肾功能关系密切第六十三页，共73页。二、尿微量蛋白检测的临床意义尿微量蛋白种类：

血浆蛋白：包括白蛋白（Aib）、IgG、IgA、IgM、轻链（κλ）、β2-微球蛋白（β2M）、补体C3、α1微球蛋白（α1M）、α2巨球蛋白（α2M）、转铁蛋白（TRF）、游离血红蛋白（Hb）、肌红蛋白（Mb）及其他血浆蛋白和酶

非血浆蛋白：肾脏的Tamm-Horsfall蛋白（THP）、SIgA、肾小球基底膜（GBM）抗原等第六十四页，共73页。三、急性时相反应物质检测的临床意义

C反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP)、IL-1、IL-6、TNF－α以及HSP等炎症分子，是发生炎症反应的标志性分子，在发生感染性疾病和自身免疫性疾病时均有不同程度的增高。第六十五页，共73页。六、常用免疫抑制药物浓度及其血药浓度监测器官移植成功的最大障碍是排斥反应。移植术后，人工调节机体的免疫状态是控制排斥反应发生的主要途径。采取的措施：1.使用免疫抑制剂，以此控制受者的免疫应答，降低

对移植物的排斥能力；2.诱导受者对移植抗原的特异性免疫耐受。第六十六页，共73页。2、生物性免疫抑制