流式细胞技术讲义

流式细胞技术讲义第1页，共52页，2023年，2月20日，星期二需求带来技术进步ELISAWesternblotImmunoarrayBiologicalchips液相蛋白的定量定性检测如何能够一个样品同时快速检测多因子ELISA??Flowcytometer??常用的检测方法Needsrisetotheevolutionofscienceandtechology!

MethodforquantificationofliquidproteinELISAWesternblotImmunoarrayBiologicalchipsCommonMethodIsthereamethodthatcanquantifymorethanoneanalytesinonesample?ELISA??Flowcytometer??第2页，共52页，2023年，2月20日，星期二ContentApplicationofeasy-to-useanalysissoftwareAdvantagesofflowcytomixtechniqueIntroductionofFlowcytomixproductionPrincipleofFlowcytomixtechnologybasedontheMicrospheresIntroductionPubulishpaper第3页，共52页，2023年，2月20日，星期二FlowCytomixTechnologyTheFlowCytomixtechnologyisbasedonthesandwichimmunoassaytechnologyMicrospheresareusedasasolidphaseinsteadofa96-wellplate20differentmicrospherepopulationscanbedistinguishedonaFlowcytometerEachbeadpopulationiscoatedwithaspecificantibody第4页，共52页，2023年，2月20日，星期二FlowCytomixareSandwichImmunoassays第5页，共52页，2023年，2月20日，星期二FlowCytomixtechnicalprinciple

20differentmicrospherepopulationscanbedistinguished

onaflowcytometerby2differentsizes9and11differentintensitiesofaninternaldye(StarfireRed)SizeASizeB第6页，共52页，2023年，2月20日，星期二20differentBeadPopulationsWithineachsetofbeads(R1orR2)distiguishedbysize

thereare9or11differentbeadpopulationsdistiguishedbytherespectiveintensityoftheinternaldye(StarfireRed)StarfireRedmeasuredinchannel3or4oftheflowcytomerdistinguishesthedifferentbeadpopulations第7页，共52页，2023年，2月20日，星期二AdvantagesImmunoassayforsimultaneousdetectionofupto20analytesPossibilitytomixandmatchallowsthecreationofcustomizedpanelsEasyhandlingin96wellplatesortubesRequiresonly25µlofsampleForserum,plasmaandcellculturesupernatantsBroadstandardrangeCanberunonmostcommerciallyavailableflowcytometersComplimentaryeasy-to-useanalysissoftware第8页，共52页，2023年，2月20日，星期二ReagentsProvidedinDifferentFormatMultiplexKitupto11plexSetupbeadsmicrospherescoatedwithcorrespondingantibodiesreferencestandardsforallcytokines(2standardcurves)detectionantibodies,biotinylatedPE-labeledstreptavidin96-wellfilterplateassay/washbuffer,CD-rom(software)SimplexKitsmicrospherescoatedwithcorrespondingantibodyreferencestandardprotein

(2standardcurves)detectionantibody,biotinylatedBasicKits(Bufferkit)SetupbeadsPE-labeledstreptavidinassay/washbufferreagentdilutionbuffer96-wellfilterplateCD-rom(software)第9页，共52页，2023年，2月20日，星期二SimplexkitsforHumanAdiponectinCD30CD40LCRPG-CSFIFN-alphaIFN-gammaIL-1betaIL-2IL-4IL-5IL-6IL-8IL-10IL-12p70IL-13IL-18TNF-alphaTNF-betaTNF-RLeptinMCP-1MIP-1alphaMIP-1betaMIGMPOOPGPAI-1ResistinT-PAsVCAM-1sPECAM-1sICAM-1sICAM-3sE-selectinsP-selectin第10页，共52页，2023年，2月20日，星期二MouseGM-CSFIFN-gIL-1aIL-2IL-4IL-5IL-6IL-10IL-17TNF-aMCP-1MCP-3MIP-1alphaMIP-1betaRANTESRatGM-CSFIFN-gIL-1aIL-4MCP-1TNF-aSimplexkitsforMouseandRat第11页，共52页，2023年，2月20日，星期二FlowCytomixMultiplexKitsHumanTh1/Th211plex BMS810FF(IFN-g,IL-1b,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12,TNF-a,TNF-b)HumanAdhesion6plex BMS812FF(sE-selectin,sICAM-1,sICAM-3,sP-selectin,sPECAM-1,sVCAM-1)HumanCardiovascular7plex BMS811FF(sCD40L,IL-6,IL-8,MCP-1,sP-selectin,t-PA,sVCAM-1)HumanChemokines6plex BMS813FF(IL-8,MCP-1,MIG,MIP-1a,MIP-1b,G-CSF)HumanObesity9plexBMS816FF

(sCD40L,sICAM-1,IL-6,Leptin,MCP-1,MPO,OPG,Resistin,sTNF-R)第12页，共52页，2023年，2月20日，星期二FlowCytomixMultiplexKits

MouseTh1/Th210plex BMS820FF(GM-CSF,IFN-g,IL-1a,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-17,TNF-a)MouseChemokines6plex BMS821FF(MCP-1,MCP-3,MIP-1a,MIP-1b,Rantes,GM-CSF)RatTh1/Th26plex BMS725FF(GM-CSF,IFN-g,IL-1a,IL-4,MCP-1,TNF-a)第13页，共52页，2023年，2月20日，星期二VacuumFiltrationManifoldFiltrationManifoldsuitablePALLcat#P/N5017BMS497FFMilliporecat.#MAVM09601BMS499FF第14页，共52页，2023年，2月20日，星期二ProtocolforFlowCytomixFlowCytomixcanbeperformedina96-wellfilterplate:beadwashingrequirevacuummanifoldorintubes:washingrequirescentrifugation200g5minsinvertthetubecarefullyPerformanceina96-wellplatehasthefollowingadvantages:WashingprocessismucheasierandfasterMulti-channelpipettecanbeusedBenchtimecanbedecreasedby70%第15页，共52页，2023年，2月20日，星期二SampleVolumeRequiredHumanAnalyteFlowCytomixELISAIFN-g25µl50µlIL-225µl50µlIL-425µl50µlIL-525µl50µlIL-625µl50µlIL-825µl50µlIL-1025µl50µlIL-12p7025µl25µlTNF-a25µl50µlTNF-b25µl100µltotal25µl575µl第16页，共52页，2023年，2月20日，星期二SuitableSamplesSerumPlasmaCellculturesupernatantsWholeBloodOtherbodyfluids

(e.g.synovialfluids,cerebrospinalfluid,bronchio-lavagefluid)第17页，共52页，2023年，2月20日，星期二FlowCytomixisSuitableformostFlowCytometers Theflowcytometerneedstobeequippedwithonelaser

(488nmor532nm)capableofdetectinganddistinguishingfluorescenceemissionsat575nm(PE)and685nm-690nm(starfirered)FlowCytomixsuitabilityhasbeentestedfor:

BDFACScanBDFACSCaliburBDFACSCantoBCEpicsXLBCFC500CyAn第18页，共52页，2023年，2月20日，星期二FlowCytomixPro2.2SoftwareFlowCytomixProSoftwareallowseasyanalysisoftherawdata(LMDdata)TheFlowCytomixsoftwareBMSFFS2.2isincludedineveryFlowCytomixBasicKitandFlowCytomixMultiplexKitsSystemsrequired:onPCcomputers:Windows98orhigher256MBRAM (recommended:512MBRAM)AppleMacintosh:OSXorhigherTheFlowCytomixProSoftwareisfreeofcharge!第19页，共52页，2023年，2月20日，星期二Comparison:

FlowCytomixandELISAPrecision:CoefficientofVariation:FlowCytomix: <10%ELISA: <10%DilutionParallelism:FlowCytomix: 88%-113%ELISA: 96%-117%StandardRange:FlowCytomix: 20000–28pg/mlELISA: 500–8pg/ml(differentinindividualanalytes)Specificity:FlowCytomix: nocrossreactivityELISA: nocrossreactivity第20页，共52页，2023年，2月20日，星期二TheoreticalSensitivitySensitivity=Thesmallestdetectableamountoftheanalyteinquestion:Analyteconcentrationresultinginafluorescentintensitysignificantlyhigherthantheblank(=mean+2standarddeviations)HumanAnalyteFlowCytomix,BMS810FFELISAIL-1b5.2pg/ml0.3pg/mlIL-220.0pg/ml15.0pg/mlIL-415.7pg/ml2.0pg/mlIL-510.0pg/ml2.2pg/mlIL-60.8pg/ml1.4pg/mlIL-87.9pg/ml11.0pg/mlIL-101.5pg/ml2.0pg/mlIL-12p7011.6pg/ml3.2pg/mlIFN-g2.2pg/ml1.5pg/mlTNF-a17.5pg/ml5.0pg/mlTNF-b3.1pg/ml2.0pg/ml第21页，共52页，2023年，2月20日，星期二AbsoluteValuesofSamples第22页，共52页，2023年，2月20日，星期二AbsoluteValuesofSamples第23页，共52页，2023年，2月20日，星期二Standard10000pg/mlStandard3333pg/mlStandard1111pg/mlStandard370pg/mlStandard42pg/mlStandard14pg/mlStandardBlankStandard123pg/ml第24页，共52页，2023年，2月20日，星期二Standard第25页，共52页，2023年，2月20日，星期二FlowCytomix–Specificity第26页，共52页，2023年，2月20日，星期二KitData+SoftwareManual(.pdf)New!!New!!FlowCytomixPro2.2ShortInstructionsFlowCytomixPro2.2Software第27页，共52页，2023年，2月20日，星期二第28页，共52页，2023年，2月20日，星期二New!!第29页，共52页，2023年，2月20日，星期二New!!第30页，共52页，2023年，2月20日，星期二第31页，共52页，2023年，2月20日，星期二S1S1S2S2S3S3S4S4S6S6S7S7S8S8S5S5New!!第32页，共52页，2023年，2月20日，星期二S1S1S5S5S2S2S6S6S4S4S8S8S3S3S7S7New!!第33页，共52页，2023年，2月20日，星期二第34页，共52页，2023年，2月20日，星期二第35页，共52页，2023年，2月20日，星期二第36页，共52页，2023年，2月20日，星期二第37页，共52页，2023年，2月20日，星期二New!!第38页，共52页，2023年，2月20日，星期二New!!第39页，共52页，2023年，2月20日，星期二第40页，共52页，2023年，2月20日，星期二New!!第41页，共52页，2023年，2月20日，星期二第42页，共52页，2023年，2月20日，星期二第43页，共52页，2023年，2月20日，星期二New!!53.23%第44页，共52页，2023年，2月20日，星期二New!!第45页，共52页，2023年，2月20日，星期二New!!第46页，共52页，2023年，2月20日，星期二New!!第47页，共52页，2023年，2月20日，星期二PublishedPaperCigarettesmokemetal-catalyzedproteinoxidationleadstovascularendothelialcellcontractionbydepolymerizationofmicrotubules

DavidBernhard,AdamCsordas,BlairHenderson,AndreaRossmann,MichaelaKindandGeorgWick

VascularBiologyGroup,DivisionofExperimentalPathophysiologyandImmunologyDepartmentBiocenterInnsbruckMedicalUniversityInnsbruck,Austria

TheFASEBJournal.2005;19:1096-1107第48页，共52页，2023年，2月20日，星期二PublishedDataExperimentalSet-up:HUVECstreatedwithcigarettesmokeextract:Samples:cellsupernatantsofHUVECsCD40L,t-PA,sVCAM-1,IL-6,IL-8,MCP-1wasmeasuredusingFlowCytomixResults:第49页，共52页，2023年，2月20日，星期二PublishedData

ImpactofInterferon-Alphaincombinedchemoradioimmunotherapyforpancreaticadenocarcinoma(CapRI):FirstdatafromtheimmunomonitoringSchmidtJ.,JägerD.,BüchlerM.W.,MärtenA.UniversityofHeidelbergDepartmentofSurgeryCancerImmunolImmunother.,2006Nov;55(11):1396-405

第50页，共52页，2023年，2月20日，星期二FlowCytomix:publisheddata

TransforminggrowthfactorbetainducedFoxP3+regulatoryTcellssuppressTh1mediatedexperimentalcolitisFantiniM.C.,BeckerC.,TubbeI.,NikolaevA.,LehrH.A.,GalleP.,NeurathM.F.

UniversityofMainz,LaboratoryofImmunologyGut2006,55;671-680.

第51页，共52页，2023年，2月20日，星期二MoreCitationsforFlowCytomixDavidBernhard,AdamCsordas,BlairHenderson,AndreaRossmann,MichaelaKindandGeorgWick.Cigarettesmokemetal-catalyzedproteinoxidationleadstovascularendothelialcellcontractionbydepolymerizationofmicrotubules(2005).TheFASEBJournal.2005;19:1096-1107(BMS711FF)ChanSiuLungA.,YipChun-HungE.,YungYingL.,PangH.,LukChui-WahS.,PangFunS.,WongHouY.Immuno-regulatoryeffectsofCKBMontheactivitiesofmitogen-activatedproteinkinasesandthereleaseofcytokinesinTHP-1monocyticcells.(2005).BiolPharmBull28(9);1645–1650.(BMS710FF)FantiniM.C.,BeckerC.,TubbeI.,NikolaevA.,LehrH.A.,GalleP.,NeurathM.F.TransforminggrowthfactorbetainducedFoxP3+regulatoryTcellssuppressTh1mediatedexperimentalcolitis(2006).Gut55;671-680.(IL-2,IL-6,IL-10,IFN-gammaSimplexKits)KozmaN.,HalaszM.,PolgarB.,PoehlmannT.G.,MarkertU.R.,PalkovicsT.,KeszeiM.,ParG.,KissK.,SzeberenyiJ.,GramaL.,Szekeres-BarthoJ.Progesterone-InducedBlockingFactorActivatesSTAT6viaBindingtoaNovelIL-4Receptor.(2006).TheJournalofImmunology176;819–826.(BMS710FF)MunitzA.,BacheletI.,EliasharR.,MorettaA.,MorettaL.,Levi-SchafferF.TheinhibitoryreceptorIRp60(CD300a)suppressestheeffectsofIL-5,GM-CSF,andeotaxinonhumanperipheralbloodeosinophils(2006).Blood

107(7);2612.(BMS710FF)RimoldiM.,ChieppaM.,SalucciV.,AvogadriF.,Sonzogni