项目生化技术生产生物药物

项目4：生化技术生产生物药物任务1：生化提取法生产木瓜蛋白酶

第一页，共三十一页。教学安排：

1.员工培训由老师讲解木瓜蛋白酶生产的理论基础及应用范围。分配实操任务：木瓜蛋白酶的生产。第二页，共三十一页。2.学生模拟组建运营一个木瓜蛋白酶生产企业，撰写计划书(在理论教学期间完成)。

市场部：木瓜蛋白酶的结构、功能、用途，木瓜蛋白酶市场状况与销售预测，原料来源状况，竞争对手状况与分析。技术部：确定木瓜蛋白酶生产的工艺流程及工艺参数，编制生产操作规程，确定生产车间的布局。第三页，共三十一页。品控部：制定木瓜蛋白酶的质量标准，生产取样分析操作规程，质量检测标准和操作规程。总经理：协调监督各部工作，最后拿出完整的计划书。第四页，共三十一页。3.计划书实施。计划书要先经过老师的审核，然后实施。实施过程中考核操作技能。实施后及时进行实训报告的撰写也总结。第五页，共三十一页。第一节生化提取技术基础第六页，共三十一页。

一药用酶的生产来源（一）药用酶的来源动植物提取法；微生物发酵法。（二）生化制备法1原料选择应注意的问题（1）酶在生物材料中的分布；

第七页，共三十一页。

（2）考虑生物的发育阶段及营养状况；（3）动物组织宰杀后立即取材；（4）生化制备的综合成本。2生物材料的预处理（1）机械处理（2）反复冻融处理第八页，共三十一页。

（3）制备丙酮粉（4）微生物细胞的预处理3酶的提取（1）水溶液法应考虑的因素：①酶稳定性；②酶的溶解度；③酶与其它物质结合的性质；第九页，共三十一页。（2）有机溶剂法；（3）表面活性剂法。4酶的纯化（1）杂质的去除杂质：杂蛋白、多糖、脂类和核酸。①调pH和加热沉淀法；第十页，共三十一页。②蛋白质表面变性法；③选择性变性法；④降解或沉淀核酸法；⑤利用结合底物保护法除去杂蛋白。（2）脱盐①透析第十一页，共三十一页。

②离子交换法；（3）浓缩①冷冻干燥法；②离子交换法；③超滤法；④凝胶吸水法；第十二页，共三十一页。（4）酶的结晶①酶的结晶方法a盐析法；b有机溶剂沉淀法；c复合结晶法；d透析平衡法；e等电点法。第十三页，共三十一页。②结晶条件的选择a酶液的纯度越纯越容易形成结晶；有纯化作用；b酶的浓度浓度越高越容易结晶；c温度低温有利；d时间好的结晶是在生长慢的条件下形成的；第十四页，共三十一页。epH值选择等电点附近；f金属离子许多金属离子有促进作用；g晶种h结晶器皿处理充分清洗、烘干。（5）酶分离和纯化过程应注意的问题①防止酶蛋白变性避免高温，避免pH值过第十五页，共三十一页。高或过低，避免剧烈搅拌，避免与重金属接触。②防止辅助因子流失③防止酶被蛋白水解酶降解；第十六页，共三十一页。（三）微生物发酵法1高产菌株的选育；2发酵工艺的优化；3培养方法；4影响酶产量的因素；（1）温度；（2）pH值；（3）通气和搅拌；第十七页，共三十一页。（4）泡沫和消泡剂；（5）添加诱导剂和抑制剂。第十八页，共三十一页。第二节木瓜蛋白酶生产技术第十九页，共三十一页。一、结构与性质木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定形粉末或颗粒。略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。最适温度65℃，易变性失活；木瓜蛋白酶等电点pI=9.6。半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。木瓜蛋白酶是单条肽链，有211个氨基残基组成，相对分子质量为23000。第二十页，共三十一页。二、生产工艺1、原料采集用锋利刀片在未成热的青果表面纵割若干条线，深度也应在2mm深以内，环绕茎干装一倒伞形收集盘，接收流下的乳汁。

第二十一页，共三十一页。每个果一次割3条线，4天割一次，每次采割时间在清晨或中午下雨后。选择2.5～3月龄已充分长大的青果采割产量最高。割后30～60s乳汁停止流出，把粘在果上的乳汁赶入收集盘混合收集。用浸过硫酸钙或杀菌剂溶液的洁净布擦净，防切口感染。

第二十二页，共三十一页。

2粗制提取工艺第二十三页，共三十一页。(1)粗制不锈钢锅中，在搅拌的条件下加入含0.1％四乙酸乙二胺化二钠和0.3％氯化钠溶液，并加入还原剂0.06mmol／L硫代硫酸钠和0.08mmol／L半胱氨酸的混合液，混匀后过滤，收集滤液。(2)干燥将滤液置于干燥机中干燥，即得粗品。第二十四页，共三十一页。3、精制工艺第二十五页，共三十一页。(1)粗制

将木瓜乳汁倾入搪瓷缸中，在搅拌的条件下加入硫酸铵使其达到45％饱和度时，木瓜蛋白酶即沉淀，然后静置过夜，离心，收集沉淀，得木瓜蛋白酶粗品，木瓜凝乳酶在上清液中。一步将两个酶分离。第二十六页，共三十一页。(2)精制

沉淀置于搪瓷缸中，搅拌下加入1倍体积的0.1％四乙酸L二胺化二钠和0.3％氯化钠溶液，并加入还原剂0.06mmol／L硫代硫酸钠和O.08mmol／L半胱氨酸的混合液，然后用0.1mol／L氢氧化钠或0.1mol／L，盐酸pH至9.0，搅匀溶解，离心或过滤除不溶物。清液取1OOmL作硫酸铵盐析曲线，得出盐析范围，先向溶液中加硫酸铵至盐析曲线的下限，拌匀，离心除不溶物，清液中补加硫酸铵至上限，静置，析出结晶，为木瓜蛋白酶结晶。第二十七页，共三十一页。(3)盐析

先向溶液中加硫酸铵至盐析曲线的下限，拌匀，离心除不溶物，清液中补加硫酸铵至上限，静置，析出结晶，为木瓜蛋白酶结晶第二十八页，共三十一页。参考工艺：木瓜乳汁提取不溶物除去木瓜蛋白酶滤液沉淀上清液（弃去）木瓜酶沉淀精制上清液（弃去）

沉淀产品干燥第二十九页，共三十一页。

作业：1、酶提取的注意事项有哪些？2、木瓜蛋白酶的有哪些用途？3、如何收集木瓜乳？4、如何精制木瓜蛋白酶？第三十页，共三十一页。内容总结项目4：生化技术生产生物药物。品控部：制定木瓜蛋白酶的质量标准，生产取样分析操作规程，质量检测标准和操作规程。第一节生化提取技术基础。杂质：杂蛋白、多糖、脂类和核酸。b酶的浓度浓度越高越容易结晶。c温度低温有利。d时间好的结晶是在生长慢的条件下形成的。①防止酶蛋白变性避免高温，避免pH值过。第二节木瓜