看第十一章原生质体培养和体细胞杂交

potatotomatopomato泡马豆目前一页\总数九十七页\编于十六点第十一章原生质体培养和体细胞杂交第一节原生质体培养第二节原生质体融合第三节以原生质体为材料的基础理论研究目前二页\总数九十七页\编于十六点(1)了解原生质体培养的意义；(2)掌握原生质体分离的大致步骤；(3)掌握原生质体培养的方法；(4)掌握原生质体融合的方凑。本章教学目的与要求目前三页\总数九十七页\编于十六点第一节原生质体培养

1概念2设备与用具3化学试剂4酶类5原生质体的分离与纯化6原生质体培养目前四页\总数九十七页\编于十六点第一节原生质体培养

1概念：1.1原生质体（Protoplast）

指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。1.2原生质体培养指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。目前五页\总数九十七页\编于十六点1.3原生质体培养的用途作为一个良好的实验系统，应用于植物细胞骨架、细胞壁的形成与功能、细胞膜的结构与功能、细胞分化与脱分化等重大理论问题的研究。作为植物生物技术的一个重要分支，应用于外源基因转移、体细胞杂交、无性系变异及突变筛选。目前六页\总数九十七页\编于十六点2设备与用具除了组织培养的设备与用具之外，一些专门的仪器和用具：目前七页\总数九十七页\编于十六点2.1倒置显微镜、荧光显微镜及照相设备血球计数板：检查原生质体或细胞培养密度。倒置显微镜:

观察培养皿、培养瓶或三角瓶中的培养物。荧光显微镜：检查原生质体活性及去壁情况时，用荧光染料染色后观察。显微照相设备：记录原生质体和细胞的生长状态。haemocytometer

http://users.ugent.be/~pdebergh/pro/pro2_p2.htm目前八页\总数九十七页\编于十六点倒置显微镜荧光显微镜目前九页\总数九十七页\编于十六点2.2细菌过滤器酶液和植物激素不能高温高压灭菌。用孔径为0.45um的滤膜滤去细菌和病毒。抽滤瓶接真空泵抽滤灭菌，也可用注射器推压过滤灭菌。目前十页\总数九十七页\编于十六点无菌微孔过滤器无菌瓶顶过滤装置滤膜Ø0.45um以下目前十一页\总数九十七页\编于十六点2.3离心机分离提纯原生质体用500转／分离心3~5min，制备酶液用2500转/分离心10min以除去残渣。目前十二页\总数九十七页\编于十六点第一节原生质体培养

1概念2设备与用具3化学试剂4酶类5原生质体的分离与纯化6原生质体培养目前十三页\总数九十七页\编于十六点3化学试剂3.1无机化学试剂分析纯试剂3.2有机化学试剂1）维生素

泛酸钙（维生素B5）、叶酸、维生素A、维生素C、维生素D、生物素、氯化胆碱、对甲基苯甲酸等。配制母液时先制备各个组分的贮液。目前十四页\总数九十七页\编于十六点2）激素与组织培养的基本相同3）渗透压稳定剂

用来保持原生质体的稳定。采用糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。浓度：-1原生质体容易吸收葡萄糖，而蔗糖对于原生质体培养不利。目前十五页\总数九十七页\编于十六点4）碳源和氮源

最常用的碳源是葡萄糖和蔗糖。有机氮源:水解酪蛋白、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸等。目前十六页\总数九十七页\编于十六点3.3凝胶剂

除使用琼脂粉外，还有琼脂糖和一些国外同类产品，如日本的GellanGum。目前十七页\总数九十七页\编于十六点4酶类植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶三种主要成分构成。纤维素酶类（Cellulase）果胶酶类（Pectolyase）半纤维素酶类（Hemicellulase）崩溃酶蜗牛酶目前十八页\总数九十七页\编于十六点第一节原生质体培养

1概念2设备与用具3化学试剂4酶类5原生质体的分离与纯化6原生质体培养目前十九页\总数九十七页\编于十六点5原生质体的分离与纯化5.1外植体的选择

注意条件：选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。植物的年龄、季节、光照、肥水条件等都明显影响原生质体的质量。多数植物以叶肉细胞，根、下胚轴、幼叶、子叶等，温室植株较好。目前二十页\总数九十七页\编于十六点禾本科植物：愈伤组织和悬浮细胞。最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。对植株进行预处理，可提高原生质体培养中的分裂频率。预处理的方式:暗处理、低温处理或预先在培养基上进行预培养。目前二十一页\总数九十七页\编于十六点5.2外植体灭菌与组织培养中的外植体灭菌相同。5.3酶解处理1)使用浓度和酶解时间

酶液的浓度和酶解时间因不同材料有所不同，一般需要经过预实验来确定。酶的选择也因材料而异，愈伤组织和悬浮细胞可用活性较强的酶如纤维素酶OnozukaRS和果胶酶PectolyaseY23等，酶的浓度也大些。而叶片等材料，酶的浓度可小些。目前二十二页\总数九十七页\编于十六点表几种酶液的组成成分材料酶液成分小麦悬浮细胞CaCl2·2H2O1470mg·L-1，KH2PO495mg·L-1，MES600mg·Ｌ-1甘露醇0.55mol·L-1,pH值5.6OnozukaRS2%,PectolyaseY230.2%水稻悬浮细胞CaCl2·2H2O1470mg·L-1，KH2PO495mg·L-1，MES600mg·Ｌ-1甘露醇0.4mol·L-1,pH值5.6OnozukaR-101%,OnozukaRS0.5%,离析酶R-101%，PectolyaseY230.1%玉米悬浮细胞CaCl2·2H2O1470mg·L-1，KH2PO495mg·L-1，MES600mg·Ｌ-1甘露醇0.5mol·L-1,pH值5.6OnozukaRS3%,离析酶R-100.5%PectolyaseY230.1%，半纤维素酶0.5%哈密瓜子叶CaCl2·2H2O1470mg·L-1，KH2PO495mg·L-1，MES600mg·Ｌ-1甘露醇0.4mol·L-1,pH值5.6OnozukaR-102%,离析酶R-101%目前二十三页\总数九十七页\编于十六点2)酶解条件

黑暗、静止，振荡，以促进酶解。酶解时间因材料而不同。不要超过24h，时间太长不利于原生质体，对以后培养中的细胞生长和分裂有影响。温度25~27℃。3)渗透浓度应试验不同渗透压浓度的细胞反应，找出适宜的渗透浓度。广泛使用的山梨醇和甘露醇浓度为0.4~0.8mol·L-1。目前二十四页\总数九十七页\编于十六点5.4原生质体的收集和纯化过滤和离心的方法进行收集和纯化。过滤:用40~100目去除杂质。离心：75~100g离心3~5min，弃去上清液，纯化：

1）再离心：先悬浮在洗液后离心，重复三次。

2）培养基清洗，离心，提取。调原生质体培养密度:104-106/ml。目前二十五页\总数九十七页\编于十六点图示原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶目前二十六页\总数九十七页\编于十六点叶片愈伤组织目前二十七页\总数九十七页\编于十六点1)形态识别

形态完整，含饱满的细胞质，有胞质环流，颜色新鲜的即为存活的原生质体。5.5活力测定目前二十八页\总数九十七页\编于十六点2)

染色识别

用0.1%酚番红或伊凡蓝或荧光素双醋酸（FDA）染色,有活力而质膜完整的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的却被染上颜色。目前二十九页\总数九十七页\编于十六点第一节原生质体培养

1概念2设备与用具3化学试剂4酶类5原生质体的分离与纯化6原生质体培养6.1培养基6.2原生质体的培养方法6.3培养条件6.4原生质体的发育和植株再生目前三十页\总数九十七页\编于十六点6.1培养基⑴培养基成分：KM－P；N6。⑵渗透压稳定剂：葡萄糖最好。随胞壁再生和细胞持续分裂，其浓度须不断降低，有利生长。⑶无机盐：降铁、增钙、降铵利于原生质体培养。大量元素含量稍低，钙离子浓度较高，采用有机氮源而少用铵盐。6原生质体培养目前三十一页\总数九十七页\编于十六点⑷有机成分：KM－P培养基中含丰富有机物质。⑸激素：必需生长素和细胞分裂素，注意其配比；调整激素要考虑后效应。不同的植物对激素的种类和浓度要求不同。常采用1～2mg/L2,4-D或配以0.2～0.5mg/L的玉米素。⑹添加天然有机物如椰汁、酵母提取物等。目前三十二页\总数九十七页\编于十六点5.3原生质体培养6.2原生质体的培养方法目前三十三页\总数九十七页\编于十六点常用液体浅层培养法和悬滴培养法。1）液体浅层培养法是将原生质体悬浮液2～3mL于三角瓶或培养皿中，每天摇动2～3次，防止原生质体沉底。优点：操作简便，对原生质体伤害小；缺点：不易定位观察原生质体，而且分布不均匀，易造成局部原生质体密度过高或粘聚，影响再生细胞的分裂和进一步生长发育。（1）液体培养法：目前三十四页\总数九十七页\编于十六点2)悬滴培养法：用滴管以0.1ml小滴接种到培养皿上，由于表面张力，小滴以半球形保持在培养皿表面。底皿加保湿液，将皿盖盖于底皿上，封口培养。优点：材料少，生长快，不易污染，易加入培养基，有利于低密度培养；缺点：原生质体分布不均匀，集中在小滴中央，且与空气接触面大，液体容易蒸发，使培养基浓度提高。目前三十五页\总数九十七页\编于十六点（2）固液双层培养法

培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。

优点：固体培养基中的营养物质缓慢释放目前三十六页\总数九十七页\编于十六点（3）固体培养法

原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37C左右）等体积混合成0.7%，培养于培养皿中。优点：便于定位观察、追踪单个原生质体再生细胞的发育进程，避免细胞间有害代谢产物的影响。缺点：操作要求严格，混合的温度掌握必须合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快，原生质体不容易混合均匀。目前三十七页\总数九十七页\编于十六点（4）念珠培养法/琼脂糖珠培养法

含有原生质体的琼脂糖培养基切成块，放在液体培养基中振荡培养。目前三十八页\总数九十七页\编于十六点6.3培养条件湿度：密封温度：25℃密度：104-106/ml。PH值：一般为。新鲜培养基的添加目前三十九页\总数九十七页\编于十六点6.4原生质体的发育和植株再生细胞壁再生分裂愈伤组织或胚状体形成植株再生目前四十页\总数九十七页\编于十六点1)细胞壁再生原生质体失去特有的球形外观，这种变化被视为再生新壁的象征.一般原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天便可形成完整的细胞壁.目前四十一页\总数九十七页\编于十六点2)细胞分裂与生长原生质体培养2-7天后,开始第一次分裂,第一次分裂的时间随植物种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。目前四十二页\总数九十七页\编于十六点原生质体的分裂目前四十三页\总数九十七页\编于十六点3)愈伤组织形成与分化2周后形成多细胞的细胞团，3周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约6周后形成直径为2mm的小愈伤组织。原生质体培养7-10天后及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长。待小愈伤组织长至1mm时及时转移到固体培养基上进一步生长。目前四十四页\总数九十七页\编于十六点肉眼可见细胞团愈伤组织器官发生途径胚胎发生途径植株4)植株再生途径目前四十五页\总数九十七页\编于十六点植株再生途径器官形成途径：一步成苗,将原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养基上。胚胎发生途径：两步法，先将愈伤组织培养在含细胞分裂素（0.5～2.0mg/L）和低浓度2,4-D(0.02～0.2mg/L)的分化培养基上，让其增殖和调整状态，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转到含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。

目前四十六页\总数九十七页\编于十六点目前四十七页\总数九十七页\编于十六点7a:分离原生质体10天后第1次分裂7b,c:2和3周龄小细胞团

7d,e:4和6周龄小愈伤组织7f:转到B5h培养基前8周龄小愈伤组织8a:转到B5H培养基上的小愈伤组织和体细胞胚诱导8b:转到Boi2y培养基上的球形胚8c:转到MS培养基上的子叶期胚以转化为小植株紫花苜蓿叶片原生质体分裂、克隆体的发育及通过体细胞胚再生小植株目前四十八页\总数九十七页\编于十六点第二节原生质体融合1概念2细胞融合的方法3细胞融合的程序4应用

目前四十九页\总数九十七页\编于十六点第二节原生质体融合

1定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交，是以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善的一门新型生物技术，是以体细胞为材料，通过物理、化学因子的诱导进行融合，得到杂种细胞的过程。目前已从许多种内、种间、属间甚至科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株，其中有的已用于生产。目前五十页\总数九十七页\编于十六点显微镜下的细胞融合过程

目前五十一页\总数九十七页\编于十六点第二节原生质体融合1概念2细胞融合的方法3细胞融合的程序4应用

目前五十二页\总数九十七页\编于十六点2细胞融合的方法自发融合：去壁的裸细胞具有彼此融合的能力，在酶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合形成同核体，原因：由于不同细胞的胞间连丝扩展和粘连造成的。自发融合是无意义，诱导融合：不同来源的原生质体细胞用物理和化学的方法诱导使之融合的过程。目前五十三页\总数九十七页\编于十六点（1）物理方法----电融合

70年代末80年代初出现。

电融合原理：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。目前五十四页\总数九十七页\编于十六点融合室电融合仪方法：把有一定密度的原生质体悬浮液置于融合室，小室两端装有电极。在不均匀交变电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。目前五十五页\总数九十七页\编于十六点电融合诱导法原理示意图目前五十六页\总数九十七页\编于十六点目前五十七页\总数九十七页\编于十六点1）在高频电流电场下的相互接触。2）脉冲刺激后30s3)50s后4）1.5min后5）6min后6）15min后，原生质体融合完成。甜菜原生质体电融合过程目前五十八页\总数九十七页\编于十六点目前五十九页\总数九十七页\编于十六点（2）化学方法采用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合。优点：操作方便，不需要价格昂贵的仪器。ANaNO3处理时间：Carlson（1972）获得了世界上第一个体细胞杂种——粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种，原理：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。缺点:异核体形成频率不高。目前六十页\总数九十七页\编于十六点B高pH-高钙处理方法时间：1973年Keller和Melchers用强碱（pH值10.5）和高钙离子（50mmol·L-1CaCl2·2H2O）溶液在37℃下处理原生质体融合。优点:杂种产量高，缺点：高pH值对细胞是有毒。C聚乙二醇（PEG）处理方法时间：

1974年高国楠等。优点：异核体形成频率高，重复性强，对大多数细胞低毒。广泛应用。结合PEG法与高pH-高钙法，效果就更好。目前六十一页\总数九十七页\编于十六点PEG法原理PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。目前六十二页\总数九十七页\编于十六点PEG法示意图-+-桥梁+-PEG被洗掉+-+-电荷重排+-+-+-+-膜接触目前六十三页\总数九十七页\编于十六点最为常用。具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞dPEG结合高钙-高pH诱导法目前六十四页\总数九十七页\编于十六点目前六十五页\总数九十七页\编于十六点目前六十六页\总数九十七页\编于十六点第二节原生质体融合1概念2细胞融合的方法3细胞融合的程序4应用

目前六十七页\总数九十七页\编于十六点

原生质体融合示意图目前六十八页\总数九十七页\编于十六点3细胞融合的程序两种亲本的原生质体分离用理化因子诱导融合异核体或杂种细胞的选择杂种细胞的培养及再生杂种细胞的鉴定等。目前六十九页\总数九十七页\编于十六点3.1两种亲本的原生质体分离原生质体分离方法见第一节。双子叶植物中不论是从外植体还是培养细胞分离的原生质体，都是细胞融合的良好材料。单子叶植物用胚性细胞，因为禾本科植物叶肉原生质体不能分裂。细胞融合要求新鲜的原生质体，因为分离纯化后的原生质体5～6h就开始长壁，有的则更快。目前七十页\总数九十七页\编于十六点3.2原生质体融合采用第一节中的方法进行。目前七十一页\总数九十七页\编于十六点细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞。A与B融合过程中，能预见哪些形式的细胞吗？A-B，A-A，B-B。A-A-A，B-B-B等多聚体。未融合的A，B。目前七十二页\总数九十七页\编于十六点融合类型同核体：同源原生质体的融合体;

如：A-A，B-B以及A-A-A，B-B-B等多聚体。异核体：非同源原生质体的融合体;

如：A-B多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体。目前七十三页\总数九十七页\编于十六点1）遗传互补筛选法：原理：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。如亲本1：叶绿体缺陷型亲本2：光致死型筛选结果：两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长。3.3异核体或杂种细胞的选择目前七十四页\总数九十七页\编于十六点2）抗性互补筛选法：原理：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。如：

亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代

亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长筛选结果：杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡目前七十五页\总数九十七页\编于十六点3）利用物理特性筛选法：原理：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体亲本2：叶肉细胞原生质体筛选结果：在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分。目前七十六页\总数九十七页\编于十六点目前七十七页\总数九十七页\编于十六点4）利用生长特性筛选法：原理：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，筛选结果：其融合细胞双亲互补可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。目前七十八页\总数九十七页\编于十六点3.4杂种细胞的培养及再生可参考本章第一节。3.5杂种细胞或杂种植株的鉴定不同基因型亲本融合形成的体细胞杂种与其亲本比较具有一些明显不同的遗传特征，表现为细胞分裂和染色体数目不稳定性、杂种植株的不育性等。

目前七十九页\总数九十七页\编于十六点形态学分析——考察双亲植物，观察其株高、株型、叶片大小、形状、气孔的大小与多少，花的形状、大小及颜色等。细胞学分析——进行染色体数的计算及形态观察。18条染色体36条染色体目前八十页\总数九十七页\编于十六点生物化学或分子生物学分析——1）同功酶谱分析，如酯酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等的同功酶；2）RuBp羧化酶分析和FractionI蛋白分析；3）叶绿体DNA、线粒体DNA、核DNA的分析，采用Southern杂交和RELP图谱分析。RAPD带型（随机扩增的多态性DNA）目前八十一页\总数九十七页\编于十六点抗性分析——检测是否存在双亲中所具有的某些抗性性状。育性分析——检查花粉粒的大小、形状、活性、能否开花结果，有无种子等。目前八十二页\总数九十七页\编于十六点异核体：亲缘关系较远的种、属间融合形成的杂种体细胞一般不发生核融合，形成异核体。

异核体常常不发生细胞分裂、或细胞分裂不同步导致细胞分裂失败、或细胞分裂几次后停止生长、或形成几十个细胞的细胞团后停止生长，致使亲缘关系较远的种、属间形成杂种几率极低。目前八十三页\总数九十七页\编于十六点

非对称杂交：一方亲本的细胞核和细胞质与另一方亲本的少量核物质（1～2条染色体）和全部细胞质融合细胞质杂交：一方亲本的细胞核和细胞质及另一方亲本的全部细胞质融合，有可能使两种来源不同的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。目前八十四页\总数九十七页\编于十六点胞质杂种的产生各种途径：

一个正常的原生质与一个去核的原生质体融合；

一个正常的原生质体和一个核失活原生质体的融合；

在异核体形成之后2个核中有1个消失；

在较晚的时期染色体选择性地消除。目前八十五页\总数九十七页\编于十六点第二节原生质体融合1概念2细胞融合的方法3细胞融合的程序4应用

目前八十六页\总数九十七页\编于十六点生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间苷蓝——青菜大豆——马唐草矮牵牛——龙面花大麦——花生大麦——大豆小麦——矮牵牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麦——蚕豆大豆——草香木犀酵母菌——鸡大豆——烟草大豆——秋水仙人——胡萝卜番茄——马铃薯叶——叶叶——根愈伤组织——叶叶——花瓣种子——种子叶——悬浮细胞叶——花瓣叶——悬浮细胞叶——悬浮细胞悬浮细胞——悬浮细胞叶——根悬浮细胞——叶原生质体——血红细胞悬浮细胞——叶悬浮细胞——叶