南农-生物分离工程-生物分离1-细胞破碎(完整)

南农--生物分离工程--生物分离1--细胞破碎(完整)第一页，共43页。概述

有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积，使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁。第二页，共43页。 分类

机械法非机械法固体剪切法(珠磨法)酶溶法液体剪切法化学降解法（酸碱法）撞击法表面活性剂法超声法干燥法渗透法冻融法第三页，共43页。本节主要研究的是革兰氏阴性原核生物。其细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链DNA上。典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。细胞膜第四页，共43页。Gram-negativeprocaryotes革兰氏阴性原核生物（E.coli）第五页，共43页。革兰氏阴性细胞结构有三层：最外层约8mm厚，酶大多数镶嵌在这层膜上。革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构，但有第二层肽聚糖层和胞浆空间。第三层为浆膜层或内膜层，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性都有这一结构，该层主要由磷脂组成，还有分散的蛋白质分子和金属离子。

第六页，共43页。这三层有不同功能。外层及肽聚糖层使细胞有一定的机械强度；破坏该层是本章讨论的重点。浆膜层和细胞内膜控制细胞的渗透压，即将营养物质运送到细胞内，将代谢物排出胞外。第七页，共43页。真核细胞，具有真正的细胞核，其结构要比原核生物复杂的多，以图所示的酵母菌为例，和原核细胞一样，真核细胞也具有一层细胞膜。第八页，共43页。动物细胞第九页，共43页。植物细胞模式图第十页，共43页。

破壁难易程度与壁强度、壁厚度、聚合物的种类、细胞的形状和大小有关细菌比真菌易破碎G+用溶菌酶G-添加EDTA，除去Ca2+第十一页，共43页。

细胞破碎理论

1)、细胞破碎A压撞B剪切C渗透冻胀D破壁破膜2)、产物释放第十二页，共43页。方法技术原理效果成本举例机械法匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎适中适中动物组织及动物细胞研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理匀浆法（孔型）须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理一、机械法第十三页，共43页。

高速珠磨机珠直径、数量、悬浮液浓度、搅拌速度珠磨法第十四页，共43页。WSK卧式高效全能珠磨机Crushinginballmill珠磨法

第十五页，共43页。ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机第十六页，共43页。高压匀浆器第十七页，共43页。影响因素操作压力p：p,R。温度2C/10MPa。破碎次数N：N，R。温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。细胞种类：如大肠杆菌比酵母易破碎第十八页，共43页。超声波破碎(15—25kHz)机理 在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。发声器和换能器

高频电流→机械振动功率、工作时间（9S）、间歇时间、工作次数、产热大、实验室第十九页，共43页。

Ultrasonication超声波超声波破碎仪

第二十页，共43页。超声破碎法第二十一页，共43页。超声破碎法优点：适合于多种细胞的破碎缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状；B、有效能量的利用率低；C、产热大，需控温；D、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。第二十二页，共43页。JJ-2组织捣碎匀浆机第二十三页，共43页。研钵第二十四页，共43页。

机械法优点A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多;B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌;C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.第二十五页，共43页。二、非机械法

第二十六页，共43页。方法技术原理效果成本举例化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏酶消化法细胞壁被消化，使细胞破碎温和昂贵增溶法表面活性剂溶解细胞壁温和适中胆盐作用于大肠杆菌脂溶法有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳适中便宜甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱的皂化作用使细胞壁融解剧烈便宜化学法第二十七页，共43页。OsmoticShock(渗透冲击法)

最简单的是渗透冲击法。此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂，释放胞内物。第二十八页，共43页。细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容易溶破，动物细胞只有当其组织被机械切碎或匀浆后才易溶破。植物细胞很难溶破，因为植物细胞中含有大量的木质成分，通过渗透流很难渗透。第二十九页，共43页。渗透流的动力来自渗透压，渗透压可以通过化学平衡来估算：

P=RTC

该式称为范特苛夫定律。许多细胞内溶质浓度大约为0.1MNaCl或0.2M溶质。第三十页，共43页。例：一种耐盐细胞其能积累细胞内低分子量卤化物，适应高渗透压，能在含有0.32mol/LNaCl,0.02mol/LMgCl2,0.015mol/LCaCl2,0.01mol/LFeCl3的培养基中培养，当其从含盐量高的培养基中转移至清水中，在数分钟内能将胞内产物释放出来，试估计细胞膜所受渗透压的大小。（设操作温度为25℃）第三十一页，共43页。解：细胞所受渗透压按照下式计算：P＝RTC＝

8.314×298×(0.32×2＋0.02×3＋0.015×3＋0.01×4)×103＝1.94×106Pa第三十二页，共43页。酶解法阳性菌：溶菌酶，分解糖苷键，低渗溶液破裂阴性菌：EDTA-溶菌酶、甘氨酸-溶菌酶、青霉素法（抑制细胞壁合成）酵母菌：蜗牛酶、纤维素酶霉菌：几丁质酶、壳聚糖酶自溶作用：加热、干燥诱发第三十三页，共43页。第三十四页，共43页。冻-融法细胞-15℃冷冻、室温融化细胞膜疏水键破裂，胞内水结晶膨胀破裂温和、破碎率低第三十五页，共43页。干燥法细胞膜渗透性改变，易抽提（丙酮、丁醇）空气干燥（酵母）25-30℃热空气真空干燥（细菌）喷雾、冷冻干燥（不稳定生化物质）第三十六页，共43页。非机械法优点：A、产品释放的选择性；B、提取速度和收效高；C、产品的破坏小；D、对外界环境，如pH和温度等要求低。第三十七页，共43页。机械法和非机械法的比较

机械破碎法缺点：A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活；B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；C、细胞碎片大小不一，难分离。

非机械破碎法缺点：A、引起新的污染，尤其是其他化学方法；B、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。第三十八页，共43页。 细胞破碎的评价

破碎率定义 N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。直接计数法方法：样本稀释---染色---上样计数。计算：同上。优点：方法简单。缺点：A、计数时间长B、细胞聚集时，不利计数C、染色误差。第三十九页，共43页。细胞破碎的评价间接计数法方法：样本离心---取上清液---测特定蛋白质或酶---与理论的最大值比较。(紫球藻细胞藻红蛋白)计算：Y(%)=100×(R/Rm) Rm：理论最大值，R：实验测得值。优点：A、方法客观可靠，尤其对蛋白质和酶，B、有多种选择的指标，胞内位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，灵活性大。缺点：影响因素多，如温度、pH值、剪切力、溶液的稀释等。解决办法：筛选相对稳定和恒定的指标。第四十页，共43页。基因工程表达产物存在的问题A、包含体B、N-端多一个蛋氨酸残基、表达产物未糖基化（大肠杆菌）C、表达产物过度糖基化，目标产物变成抗原（酵母）D、大肠杆菌的内毒素包含体（一般步骤）A、包含体的分离B、包含体溶解、变性、还原，一般用尿素、盐酸胍、SDSC、变形蛋白质的复性D、一般的分离纯化第四十一页，共43页。

基因工程表达产物例：人-干扰素的后处理工艺发酵液离心(发酵液冷却至10C以下，4000r/min离心10min)菌体细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积buffer,冰浴超声破碎5次,30s/次,4000r/min离心30min)，洗涤(