化学合成分离技术

层析别离技术李旭琴2019-4-181层析法分类(1)按两相的状态来分：(2)按固定相的使用形式〔即实验技术〕分：柱层析(CC)、薄层层析(TLC)、纸上层析(3)按别离机制〔即物理化学性质〕分：吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等(4)按展开方式分：洗脱法、迎头法、置换法

流动相固定相21.1柱层析原理1.2柱层析技术1.3柱层析本卷须知目录1.柱层析(CC)2.薄层层析(TLC)31.1柱层析原理：吸附柱层析是利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分别离。固定相：固体吸附剂流动相：即洗脱剂

目前，我们最常用的就是以硅胶、氧化铝两种物质为填充剂的色谱柱，常称为：硅胶柱和氧化铝柱。1.柱层析(CC)4

当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，由于不同的化合物吸附能力也不同，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。吸附柱色谱通常在玻璃管中填入外表积大，经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待别离的混合物流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。柱层析原理：5上样洗脱装柱1.2柱层析技术柱层析的装柱比较重要，装柱的效果直接影响层析别离效果。因此，是制备性别离的一种根本操作技能。6称量：200-300目硅胶，称10-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。搅成匀浆：参加干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/甲醇体系，就用氯仿拌。装柱步骤7(3)装柱：将柱底用少许脱脂棉轻轻塞紧，再盖一层厚的石英砂，关闭活塞，向柱中参加约1/3体积石油醚〔氯仿〕，翻开柱下活塞，将匀浆(硅胶或氧化铝与溶剂的混合物)经漏斗一次倒入柱中，使硅胶(或氧化铝)自然沉降。再在上面加厚的石英砂。保持一定流速，不能使液面低于石英砂上层。(4)压实：沉降完成后，参加更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使别离度提高很多，且可以防止过柱时由于柱床萎缩产生开裂。8装柱子〔添硅胶〕时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱。湿法装柱：是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用洗脱剂“走柱子〞，本法最大的优点是柱子装的比较结实，没有气泡。装柱方法9干法装柱干法装柱：将干吸附剂〔未与洗脱剂混合〕装柱，是直接往柱子里填入硅胶，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至适宜高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是设法将样品加到上面，从柱项参加洗脱剂，“走柱子〞。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。10优点是：较方便，别离效率高，别离效果与制备性薄层层析相似，可以将薄层层析的别离条件直接用于干柱层析，从而别离出更多量的化学成分。缺点在于：由于溶剂和硅胶之间的吸附放热，容易产生气泡，这一点在使用低沸点的洗脱剂如乙醚，二氯甲烷时最为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易觉察，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上别离了。解决的方法是：硅胶一定要填结实；一定要用较多的溶剂“走柱子〞，等到柱子的下端不再发热，恢复到室温后再撤去压力。干法装柱优缺点11层析柱硅胶的用量一般是每别离1g产品使用30-100g硅胶柱子的形状比例一般是内径:高度=1:8~10不管干法还是湿法，硅胶〔固定相〕的上外表一定要平整，并且硅胶〔固定相〕的高度一般为15cm左右，太短了可能别离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致别离效果不好。溶剂尽量使用能够分开的极性最低的溶剂湿法装柱时最好是先在底部装有石英砂的柱子中预加溶剂再按湿法加料这样能保证一开始参加的填料处于全湿状态，杜绝气泡刚装的柱子在一段时间内可能会有长度变短的现象所以稳定一段时间后再使用装柱要领：要做到密实均匀无气泡。经验：万一装柱时带入气泡，可从上端压入大量溶剂将气泡从下端挤出。装柱注意12上样:又称加样或样品上柱。也有干法和湿法之分。干法上样就是把待别离的样品与易挥发溶剂混合后，再与吸附剂吸收、挥干挥发性溶剂后，撒布于柱的上端。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂〔最好就是柱层析所用的洗脱剂，如果溶解度不好，那么可以用一极性较大的溶剂，但必须少量〕将样品溶解，再小心的参加层析柱项端的平面内。湿法较方便。加样的根本要求是均匀薄饼样层。上样13洗脱洗脱：柱层析所用的溶剂，习惯上称为洗脱剂。洗脱操作的目的当然是要将参加的样品中各个组分先后从上往下带出来，并能分开收集各成分。洗脱的过程中，上端溶剂不能干，分段收集是关键；下端烧杯定时换，薄层纸层化学检；洗脱剂可随意变，混合过渡为重点。1415收集的试管大小要以样品量而定。一般采用几个试管〔或锥形瓶〕进行收集，通过对收集的几瓶洗脱液进行薄层分析判断是否为需要的产物，合并需要的溶液，浓缩，经过这样的掐头去尾就可以得到符合要求的样品了。溶液接收及检测161.3柱层析本卷须知：(1)先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化。(2)棉花不要塞的太紧，否那么影响洗脱速度。(3)色谱柱要填装紧密，将柱子必须装平整、均匀(4)样品层要上的薄，考虑有限柱填料的吸附量(5)可考虑用梯度法分开并洗脱(6)固定相要始终浸于溶液中，防止柱身干裂。(7)色谱柱的活塞不涂凡士林。17薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂，待别离样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流动，从而使各组分得到别离的物理方法。常用的支持剂有：硅胶G、硅胶GF254、氧化铝、纤维素、硅藻土等。使用的支持剂种类不同，其别离原理也不尽相同，有分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析等多种。2.薄层层析(TLC)2.1TLC原理18先做TLC检视成分的多少主点和次点：点样展开显色2.2TLC分析技术以毛细管吸取样品点在起跑线上，少量屡次，直径不超过2mm，点完后，以紫外灯照射以确定浓度适当。点样：19显色如果组分有色，可得到有色斑点，那么不需显色；当组分无色时，需要显色。一般有两种显色方法：(1)紫外光显色法：应用铅笔描出斑点位置。(2)显色剂显色法：用化学试剂作显色剂，以显示组分斑点的位置。20TLC分析技术影响Rf的主要因素：

(1)吸附剂

(2)溶剂体系

(3)样品本身性质

(4)温度

(5)pH比移值：表示某组分移动速率的快慢，用Rf

表示。ab21别离效果和所用硅胶有关系。不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在各厂家的硅胶中别离效果有差异。鉴于此，硅胶一定要密封保存，防止吸潮。TLC所用的硅胶板一定要保存在枯燥器里面，或使用前在红外烘箱里枯燥一段时间。溶剂的含水量和杂质含量对别离效果都有明显的影响。温度对别离效果影响也很明显。在实验过程发现，在夏天别离相同的产品，所需的洗脱剂极性要比在冬天小很多。22展开剂体系极性小的用石油醚：乙酸乙酯体系

极性较大的用氯仿：甲醇体系

极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸体系

拖尾可以参加少量氨水或冰醋酸TLC分析技术23选择适当的展开剂是首要任务一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往往不能到达很好的别离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：石油醚:乙酸乙酯，石油醚:丙酮，石油醚:乙醚，石油醚:二氯甲烷，氯仿:丙酮，二氯甲烷:甲醇，氯仿:甲醇24展开剂的比例展开剂的比例要靠尝试，一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个别离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来到达最正确效果。一般把两种溶剂混合时，采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂，如果有分开的迹象，再调整比例，到达最正确效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。25

对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。当然，选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。展开剂262.3TLC本卷须知(1)某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开。一般以目标产物的Rf值在左右为最正确。(2)样品点不能点得太浓，否那么容易重叠，不易判断，因为如果两个点相近的话，一浓就变成一个点。(3)板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较适宜了，才能有一个较好的别离效果。27TLC跟踪反响在点板的时候往往是反响体系的混和溶液点一个点A，每种难挥发的原料各点一个点B,C,D等等，然后所有的原料和反响体系的混合溶液再共同点一个混合点X，这些点在板上的位置如下图：28这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的点与B,C等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。AXBCD29TLC判断纯度

利用TLC判断物质的纯度时，往往要和NMR相结合，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。但由于1HNMR可鉴别的纯度也就在95%左右，有时候1HNMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。30W.ClarkStill,MichaelKahn,andAbhijitMitra,RapidchromatographictechniqueforpreparativeseparationswithmoderateresolutionJ.Org.Che