动物细胞工程【北京1中学内部】

第三节动物细胞工程周斌2011年3月目前一页\总数六十三页\编于四点动物细胞工程常用技术手段

动物细胞培养：动物细胞工程的技术基础

动物细胞核移植动物细胞融合生产单克隆抗体目前二页\总数六十三页\编于四点一、动物细胞培养概念：从动物机体中取出相关的组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的环境中，让这些细胞生长和增殖。理论基础：动物细胞可以在体外增殖目前三页\总数六十三页\编于四点（一）动物细胞培养的过程原代培养传代培养目前四页\总数六十三页\编于四点动物细胞培养过程1.取胚胎或幼龄动物活组织或器官，如孵育13d或16d的鸡蛋。2.胰蛋白酶使组织分散成单个细胞，配成悬浮液在培养瓶中培养，这个过程叫原代培养。3.原代培养的细胞分瓶培养叫传代培养。传代培养10代后大部分死亡，少数能传到40~50代。其中大部分细胞又不再分裂而衰老死亡，但少数细胞遗传物质改变，并带有癌变特点，能在培养条件下无限增殖。目前五页\总数六十三页\编于四点动物细胞培养过程的两个现象细胞贴壁：悬液中分散的细胞贴附在瓶壁上生长。接触性抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖。目前六页\总数六十三页\编于四点细胞贴壁过程目前七页\总数六十三页\编于四点细胞在贴壁生长过程中,随着细胞分裂,数量不断增加,最后形成一个单层,此时细胞间相互接触,细胞分裂和生长停止。接触抑制目前八页\总数六十三页\编于四点（二）动物细胞培养条件1、无菌、无毒的环境原因：1)离体的动物细胞失去了机体免疫系统的保护，非常容易被微生物感染；2)细胞在代谢过程中积累的产物不能及时排出，容易对自身造成毒害。措施：1)对培养液、操作工具、培养环境做无菌处理，在培养液中加适量抗生素；2）定期更换培养液。目前九页\总数六十三页\编于四点2、适宜的营养物——培养液培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、维生素、微量元素、动物血清等。目前十页\总数六十三页\编于四点适用于培养哺乳动物的典型培养基成分氨基酸精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸维生素生物素、胆碱、叶酸、烟酰胺、泛酸、硫胺素、维生素B6、核黄素盐类NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2其它葡萄糖、青霉素、链霉素、酚红、全血清目前十一页\总数六十三页\编于四点3、温度和pH：温度：36.5℃

+/-0.5℃

pH值：。4、气体环境：氧气（细胞代谢必需）二氧化碳（维持pH），95%空气加5%CO2混合气体的培养箱进行培养。目前十二页\总数六十三页\编于四点动物细胞培养的有关问题培养的细胞为什么要取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织？动物细胞培养是否体现了细胞的全能性？为什么？组织细胞分散用胰蛋白酶，说明细胞间的连接物质的化学本质是什么？为什么要用胰蛋白酶，能用胃蛋白酶吗？胰蛋白酶的处理时间能否随机？为什么？动物细胞培养的培养基与植物组织培养基有什么不同？动物细胞培养基为什么要加动物血清？需要加什么动物血清？为什么？目前十三页\总数六十三页\编于四点胰蛋白酶会消化细胞吗？胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质为，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用；作用时间太短，细胞不容易脱落，因此必须控制好作用时间。实际应用中的处理：做预实验，摸清效果最好时的胰蛋白酶的用量和作用时间。传代代数与细胞的世代是一个概念吗？不是一个概念。在细胞培养时，所说的“第10代细胞”仅指该细胞已经传代10次；细胞传一代后，一般能倍增3-6次，经过三个阶段，即潜伏期、指数生长期和平台期。当细胞达到平台期时，需要进行传代培养，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至死亡。CO2培养箱的作用时什么？细胞培养的培养箱一般称为CO2培养箱，气体环境95%空气和5%CO2。作用是维持培养液的Ph。培养时，培养液中加入NaHCO3，来调节PH，NaHCO3有释放CO2的倾向，培养箱中的CO2可以抑制反应，所以培养箱中的CO2浓度与培养液中NaHCO3浓度相平衡。如果将CO2改为O2是不行的，氧气是氧化剂，浓度高会损伤细胞，培养时还常常加入一些抗氧化剂等。目前十四页\总数六十三页\编于四点（三）动物细胞培养技术的应用生产蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体。培养基因工程中使用的受体细胞。培养细胞用于体外检测有毒物质，判断物质的毒性。如检测致畸、致癌物质。培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、病例、药理等方面研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。如为皮肤大面积烧伤病人培养皮肤细胞进行皮肤移植。目前十五页\总数六十三页\编于四点ESC典型的不对称分裂,具慢周期性和高增殖性.ESC的标记蛋白是角蛋白K19.

组织工程皮肤是一个极热门的话题.如体外培养表皮和真皮,用以修补皮肤损伤.表皮干细胞.ESC目前十六页\总数六十三页\编于四点人耳小白鼠目前十七页\总数六十三页\编于四点组织工程鼻软骨目前十八页\总数六十三页\编于四点组织工程耳软骨目前十九页\总数六十三页\编于四点荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验原理：细胞膜的流动性目前二十页\总数六十三页\编于四点二、动物细胞融合与单克隆抗体（一）动物细胞融合概念：是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，也叫动物细胞杂交。融合后形成的具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。目前二十一页\总数六十三页\编于四点1、动物细胞融合的过程具有不同DNA的两个细胞灭活病毒诱导细胞融合（先质后核）融合后的杂交细胞进行有丝分裂目前二十二页\总数六十三页\编于四点问题为什么灭活的病毒可作为诱导动物细胞融合的诱导剂？不灭活的病毒能作为诱导剂吗？病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。不灭活的病毒会感染细胞，不能诱导细胞融合。目前二十三页\总数六十三页\编于四点仙台病毒用作融合剂的病毒必须先用紫外线或β-丙内酯灭活，以使其感染活性散失，同时保留融合活性。用灭活的仙台病毒诱导融合的效率高，对各种动物细胞都适用，并且能在鸡胚中大量培养。但是仙台病毒不稳定，保存中融合活性易降低，且制备麻烦，所以实际常用聚乙二醇诱导融合或电场诱导融合。目前二十四页\总数六十三页\编于四点细胞融合过程中两个细胞膜的变化目前二十五页\总数六十三页\编于四点显微镜下的细胞融合过程

目前二十六页\总数六十三页\编于四点物理方法：离心、振动、电激化学方法：PEG生物方法：灭活的病毒（如仙台病毒）诱导动物细胞融合的常用方法目前二十七页\总数六十三页\编于四点形成杂交细胞获得杂种植株结果物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较融合前处理用纤维素酶、果胶酶去壁用胰蛋白酶使细胞分散目前二十八页\总数六十三页\编于四点2、动物细胞融合的意义和应用意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。应用：用于研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等，特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。目前二十九页\总数六十三页\编于四点（二）单克隆抗体技术抗体是怎样产生的？问题每一个B淋巴细胞只合成和分泌一种特异性抗体。目前三十页\总数六十三页\编于四点产量低、纯度低，特异性差、灵敏度低。抗体的传统生产方法的不足：思考：如何大量获取某一种特定抗体？目前三十一页\总数六十三页\编于四点科勒GeorgesJ.F.Köhler德国巴塞尔免疫研究所

1946年--1995年米尔斯坦CésarMilstein英国英国医学研究委员会

分子生物实验室1927年--荣获1984年诺贝尔生理学或医学奖1975年发明单克隆抗体技术目前三十二页\总数六十三页\编于四点

设计方案：一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖单克隆抗体既能分泌特异性抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞目前三十三页\总数六十三页\编于四点单克隆抗体制备过程目前三十四页\总数六十三页\编于四点杂交瘤细胞1杂交瘤细胞2杂交瘤细胞3Mab1Mab2Mab3抗原目前三十五页\总数六十三页\编于四点单克隆抗体制备提取单克隆抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养分泌特异性抗体大量增殖灭活仙台病毒或PEG目前三十六页\总数六十三页\编于四点BBBB瘤瘤瘤瘤１、细胞融合后培养液中有几种细胞？筛选杂种细胞思考：杂交瘤细胞２、制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？细胞融合技术、细胞培养技术目前三十七页\总数六十三页\编于四点第一次筛选得到杂交瘤细胞细胞合成DNA有两条途径：一为主要途径，利用糖和氨基酸合成核苷酸，氨基碟呤可阻断该途径；二为补救途径，通过磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷合成核苷酸。骨髓瘤细胞缺乏HGPRT和TK，只能通过一途径合成核苷酸而增殖。淋巴细胞具备两条途径，但不能无限增殖。使用选择培养基---HAT培养基，此培养基中含有次黄嘌呤（Hypoxathine）、胸腺嘧啶核苷(Thymidine)、氨基喋呤（Aminopterin）。在HAT培养基中，小鼠瘤细胞因不能合成核苷酸而死亡，B淋巴细胞寿命有限也自然死亡，只有杂交瘤细胞从B细胞获得HGPRT或TK基因,表达得到HGPRT或TK，利用二途径合成核苷酸而无限增殖，能在HAT培养基上生长繁殖。所以最后存活下来的一定是杂交瘤细胞。目前三十八页\总数六十三页\编于四点第二次筛选出一个只产生特异抗体的杂交瘤细胞。阳性克隆筛选：用酶联免疫吸附试验（ELISA）检验特异性抗体单克隆抗体的扩大生产：（1）腹腔积液型（2）细胞生物反应器目前三十九页\总数六十三页\编于四点单克隆抗体的概念单:单个细胞克隆:无性繁殖抗体:化学性质单一、特异性强单克隆抗体的概念：是指单个杂交瘤细胞无性繁殖（克隆）形成的细胞系产生的抗体。单克隆抗体的优点特异性强、灵敏度高、能大量制备目前四十页\总数六十三页\编于四点①诊断疾病（识别作用，如同位素标记单克隆抗体，可诊断肿瘤、心血管畸形等）单克隆抗体的应用优点：准确、高效、简易、快速②用于治疗疾病和运载药物（主要用于癌症治疗，也可运载药物，如“生物导弹”）（导向作用，作为载体，生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤）（位置准确、疗效高、副作用小）目前四十一页\总数六十三页\编于四点人的单克隆抗体生产存在许多问题：①致敏问题人们努力寻求的抗体往往是针对有毒抗原的，无法直接用这样的抗原去刺激某人体，并试图获得相应的B淋巴细胞。②杂交瘤细胞不稳定目前世界上已建立一些人骨髓瘤细胞株，它们和人的淋巴细胞融合后也能产生抗体，然而未能获得像小鼠骨髓瘤系那样理想的株系。产生的杂交瘤细胞存在也不够稳定，抗体效价也不够理想。③抗体的生产问题已建株的细胞在体外培养较困难，若能在体内培养则较容易，这对于动物可以，然而用人的腹腔液培养就不可能。④转化细胞不稳定用病毒转化B淋巴细胞细胞也可建立细胞株系，但传代后只有小部分细胞分泌特异抗体，且细胞随传代递减，很难建立起长期稳定的细胞株。人—鼠细胞杂交也可以，但随着细胞的分裂，人的染色体会大量丢失。目前四十二页\总数六十三页\编于四点问题我们能否利用类似植物组织培养获得完整植物体的方法培养动物细胞，使其发育成一个完整的个体？不能，高度分化的植物细胞仍保持着全能性，而动物细胞的全能性会随细胞分化程度的提高逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。所以目前还不能利用类似植物组织培养的方法获得完整的动物体。目前四十三页\总数六十三页\编于四点多莉与威尔莫特目前四十四页\总数六十三页\编于四点三、动物体细胞核移植和克隆动物概念：将动物的一个细胞(供体细胞)的细胞核，移入另一个已经去掉细胞核的卵母细胞(受体细胞)中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。理论基础：动物细胞(核)的全能性克隆动物：用核移植方法培育的动物。目前四十五页\总数六十三页\编于四点（一）哺乳动物核移植的类型胚胎细胞核移植体细胞核移植容易困难目前四十六页\总数六十三页\编于四点（二）体细胞核移植的过程（以高产奶牛为例）体细胞培养取出核甲牛乙牛MⅡ卵母细胞去除核去核卵母细胞重组卵细胞核植入卵裂早期胚胎代孕母牛丙移植体细胞群克隆牛细胞核移植胚胎移植物理或化学方法激活目前四十七页\总数六十三页\编于四点显微操作仪目前四十八页\总数六十三页\编于四点细胞核的吸取目前四十九页\总数六十三页\编于四点1切开卵母细胞透明带2挤出卵母细胞细胞核3注入供体细胞核4电融合仪融合培养12345目前五十页\总数六十三页\编于四点受体细胞为减数分裂第二次分裂中期（MⅡ）的卵母细胞。重组细胞需通过物理或化学方法激活，从而完成细胞分裂和发育进程。体细胞核移植的技术操作过程主要包括核供体细胞和核受体细胞的处理和制备、核移植、构建重组胚胎、胚胎移植等步骤。目前五十一页\总数六十三页\编于四点问题用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，这是为什么？培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质也可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。目前五十二页\总数六十三页\编于四点问题利用体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？克隆动物DNA主要来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。所以用体细胞核移植方法克隆的动物并不是供核动物完全相同的复制。目前五十三页\总数六十三页\编于四点目前五十四页\总数六十三页\编于四点克隆技术的设想是由德国胚胎学家于1938年首次提出的，1952年，科学家首先用青蛙开展克隆实验，之后不断有人利用各种动物进行克隆技术研究。

自从1996年世界第一只体细胞克隆动物小羊“多利”诞生后，各种克隆动物如雨后春笋般地纷纷问世。

蛙：青蛙是第一种被用于克隆实验的动物。1952年，科学家首次通过从发育到后期的胚胎中提取细胞核进行克隆实验，但失败了。1970年，英国生物学家用同样方法尝试克隆，结果青蛙卵发育成了蝌蚪，但它在开始进食以后就死亡。

鼠：第一只体细胞克隆鼠名叫“卡缪丽娜”，1997年10月3日出生。目前日本、英国、美国和意大利等国的科学家已经获得了“克隆的克隆”的第二及第三代克隆鼠。世界克隆动物诞生记目前五十五页\总数六十三页\编于四点牛：能都和加贺是最早的两头体细胞克隆牛，1998年7月5日出生在日本。尽管这两头牛早产近40天，但发育正常。

猴：在目前所有克隆动物中，猴子在基因上与人类最接近。2000年1月，美国科学家宣称第一次成功地克隆出灵长类动物———一只名为“泰特拉”的克隆猴。

猪：体细胞克隆羊与克隆鼠诞生后，科学家就计划克隆猪。首批体细胞克隆猪共5只，出生于2000年3月5日。

猫：2002年初，世界上第一只体细胞克隆猫诞生了，名为CC。CC的皮毛颜色很特别，它花白的毛色看上去完全不像生它的花斑猫妈妈，也不完全像它的基因妈妈。CC来到这个世上很不容易，科学家共实验了188次才获得了成功。

兔：科学家进行了数次实验，共培育了2000多个转基因卵细胞，但最后只有6只于2002年培育成功，其中有2只在哺乳期夭折。目前五十六页\总数六十三页\编于四点骡子：2003年5月29日美国科学家宣布成功培育出一头克隆骡子。这不仅是世界范围内第一次克隆出马科动物，也是克隆杂种动物的首次成功尝试马：2003年8月6日，意大利北部克雷莫纳市繁殖技术与家畜饲养实验室的科学家宣布克隆马获得成功。它是世界上首例哺乳动物生下它自己的克隆体。这只小雌马的名字是“普罗梅泰亚”，出生时体重36公斤。鹿：2003年12月22日，美国研究人员宣布成功培育出世界上第一头克隆鹿。科学家通过细胞核移植技术培育出克隆胚胎，并将其植入代孕母鹿体内，最终获得了克隆小鹿。目前五十七页\总数六十三页\编于四点绵