食品发酵工程 10酶制剂

PAGEPAGE1第十章酶制剂工业1.前言1.1工业酶制剂的来源及特点来源：动物：猪胰蛋白酶、胃蛋白酶植物：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、麦芽淀粉水解酶微生物：酶的主要来源。工业生产的酶制剂80％是由微生物来制造的，原因是：①微生物繁殖速度快。20－30min一代，为农作物的500倍，家畜的1000倍；②微生物种类繁多，品种全。可以产生适应不同环境的酶，如高温酶、低温酶、耐酸、耐碱等；③微生物培养方法简单。原料简单，易于大批量生产80%的工业酶是水解酶，用于降解Protein、strach、lipid。淀粉酶（烘焙、酿造、淀粉糖化、纺织业）、蛋白酶（去污剂、奶制品业、皮革业）和脂肪酶（去污剂、食品、精细化工）是目前工业应用的三大主要酶制剂。1.2酶的发酵生产历史⑴1920s，法国人Biodin和Effront在德国建厂生产枯草杆菌淀粉酶来代替麦芽淀粉酶，用于棉布腿浆，为微生物酶制剂工业奠定了基础。⑵1940s，液体深层发酵技术用于淀粉酶的生产，酶制剂工业跨进了工业化生产的时代。⑶1950s，糖化酶成功用于葡萄糖生产，革除了沿用上百年的酸水解工艺。⑷1960s，加酶洗涤剂流行，进一步促进了酶制剂工业的发展。⑸1970s，固定化葡萄糖异构酶用于生产果葡糖浆，大大推动了食品工业与酶制剂工业的发展。⑹1971年，在美国召开第一届国际酶工程会议，把大规模生产、分离纯化、固定化技术、酶蛋白的改造和修饰、酶反应器设计、酶的工业化应用都纳入酶工程范围。★按细胞分类：微生物发酵产酶植物细胞发酵产酶动物细胞发酵产酶★发酵生产酶的细胞必需具备的条件：①酶的产量高；②产酶稳定性好；③容易培养和管理；发酵周期短，营养需求简单；④产物杂质少，利于酶的分离纯化；⑤安全可靠，非致病性。★动植物细胞培养缺点：①动植物细胞体积大、对剪切力敏感，要求特殊生物反应器。

动物细胞培养方法：悬浮培养，依附培养，固定化细胞培养。

植物细胞培养方法：悬浮培养，摇瓶，通用式发酵罐，气升式、鼓泡式、旋转圆筒式。②动植物细胞生长速率、代谢速率低，发酵周期长，对防止杂菌污染的技术要求高。③动物细胞营养要求苛刻。★常见酶发酵生产用微生物:Bacillussubtilis：-淀粉酶，中性蛋白酶Esherichiacoli（胞内酶）：－半乳糖苷酶，谷氨酸脱羧酶，天门冬酸酶，苄青霉素酰化酶，限制性核酸内切酶，DNA聚合酶，DNA连接酶，核酸外切酶Aspergillusniger：糖化酶，果胶酶，纤维素酶，半纤维素酶，葡萄糖，氧化酶，酸性蛋白酶，柚苷酶，Aspergillusoryzae：淀粉酶，中性蛋白酶，果胶酶，氨基酰化酶、脂肪酶，磷酸二酯酶Rhizopus：糖化酶，转化酶，脂肪酶，酸性蛋白酶，半纤维素酶Mucor：蛋白酶，糖化酶，脂肪酶，凝乳酶Penicillium（产黄青霉）：葡萄糖氧化酶，青霉素酰化酶，果胶酶，纤维素酶，桔青霉，5‘－磷酸二酯酶，脂肪酶，葡萄糖氧化酶，核酶酶，凝乳蛋白酶，Trichoderma：纤维素酶，17-羟化酶Streptomyces：葡萄糖异构酶，中性蛋白酶，几丁质酶Saccharomycescerevisiae：转化酶Candida：脂肪酶，转化酶，尿酶，乳糖酶脆壁酵母：乳糖酶2酶的发酵生产在应用微生物中，所有对微生物或其它生物细胞的培养（动物、植物细胞）的培养，通称为发酵。在现代工业中，酶的大量生产主要靠细胞发酵的方法生产。按细胞分类：微生物发酵产酶、植物细胞发酵产酶、动物细胞发酵产酶按细胞培养方式的不同分类：固体培养发酵、液体深层发酵、固定化细胞发酵2.1淀粉酶类的生产淀粉酶是最早实现工业化生产并且至今为止应用最广、产量最大的一类酶制剂，几乎占整个酶制剂总产量的50％以上。主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶。2.1.1α-淀粉酶的工业化生产2.1.1.1菌种主要为细菌和霉菌。芽孢杆菌所产α-淀粉酶分为液化型和糖化型，但只有液化型有用。枯草杆菌所产淀粉酶为大多数工厂采用，如液化酶BF-7689（我国淀粉糖工业使用），Tenase（美国）。地衣芽孢杆菌的酶耐热型比枯草杆菌的高，但产量较低，芽孢杆菌易于退化和遭受噬菌体感染而降低产酶能力。由于不断的选育改良，现在工业生产上用的菌种产生α-淀粉酶的能力已是原始菌株的数倍乃至数十倍。所采用的方法有：用诱变剂进行诱变；基因工程菌等等。如将α-淀粉酶活性高而耐热性差的枯草杆菌纳豆株的DNA转入耐热性强而酶活性低的枯草杆菌Marburg株中，结果引起了后者遗传性状的改变。2.1.1.2生产过程霉菌的α-淀粉酶大多采用固体曲法生产；细菌α-淀粉酶则以液体深层发酵为主。固体培养：以麸皮为主要原料，添加米糠或豆饼的碱水浸出液，以补充氮源。在相对湿度90％以上，芽孢杆菌用37℃，曲霉用32－35℃培养36－48h后，立即在液体培养：以麸皮、玉米粉、米糠、玉米浆等为原料，并适当补充硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机氮源，此外还需添加少量镁盐、磷酸盐、钙盐等。固形物浓度一般为5－6％。以霉菌为生产菌时，宜采用微酸性，而细菌宜在中性至微碱性培养。发酵结束后，调pH到6左右，加入40％左右的硫酸铵静置沉淀，倾去大部分上清夜后，加入硅藻土为助滤剂，收集沉淀于40℃下风干，为了加速干燥，减少失活，酶泥中可拌入大量硫酸钠，磨粉后加入淀粉、乳糖、CaCl2酶的提取：微生物的α-淀粉酶大部分分泌到细胞外。麸曲中的α-淀粉酶可用水或1％的食盐水浸出（固液比1:3-4）。工业上浓缩回收α-淀粉酶常用盐析、有机溶剂沉淀和淀粉吸附三种方法。枯草杆菌BF-7689是我国产量最大、用途最广的一种液化型淀粉酶，其最适pH6.5左右，pH低于6或高于10酶活显著降低，最适温度65℃作用，60℃以下稳定。在淀粉浆中酶的最适温度80-85℃，902.1.1.3耐高温α-淀粉酶的生产普通的细菌α-淀粉酶在水解谷物淀粉时，由于液化温度只能在80-90℃，经常残留聚合度为30－40的不溶性淀粉，妨碍了过滤并以下下一步糖化的DE值。为此，在液化时须添加许多的钙离子以提高酶的耐热性，产品中含有大量的无机盐。耐热性从α-淀粉酶适合于高温（105-110耐高温α-淀粉酶产生菌几乎都是地衣芽孢杆菌及其突变株，主要原因是该菌耐热性好和产酶活力高，因此适合于工业化生产。国内外生产厂家有无锡酶制剂厂、丹麦NOVO公司（产品Thermamy）、美国Mils公司（产品Takahern）、荷兰Gist公司（产品Maaxamyl）。2.1.2β-淀粉酶的工业化生产β-淀粉酶广泛存在于大麦、小麦、甘薯、豆类和一些蔬菜中。商品β-淀粉酶主要是从植物大豆、麦芽和甘薯中提取，细菌β-淀粉酶的生产还不多，主要的菌种有芽孢杆菌属的多黏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等。紫皮甘薯中β-淀粉酶活性最高，将甘薯磨浆提取淀粉后的新鲜废水（pH5.5-6.0），用醋酸或盐酸调节pH4.5-3.7以后，可将80％的β-淀粉酶沉淀析出。麸皮中的β-淀粉酶活力和大麦芽相当，且不含α-淀粉酶，故可不必精制，而用在麦芽糖浆的生产。2.1.3葡萄糖淀粉酶的工业化生产葡萄糖淀粉酶只存在于微生物界，许多霉菌都可以生产葡萄糖淀粉酶。工业生产用的菌种是根霉、黑曲霉以及拟内孢霉等真菌，其中黑曲霉是最重要的生产菌种。葡萄糖淀粉酶是胞外酶，可以从培养液中提取处理。它是唯一用150m3根霉型葡萄糖淀粉酶：对淀粉的水解率为100％；黑曲霉型葡萄糖淀粉酶：对淀粉的水解率为80％。两种酶的区别在于对磷酸键的水解力不同。工业化生产：⑴最初采用根霉的固体培养。菌种为河内根霉，以麸皮为碳源，添加硫酸铵。⑵黑曲霉的液体深层培养。1978年，中科院微生物所以从土壤中分离出的As.niger202作为出发菌株，经反复诱变得到UV-11高产糖化菌株。培养基：玉米粉12％，黄豆饼粉4％，麸皮1％，以100u/g淀粉加α-淀粉酶，pH调至4.5以下。通风培养90－110h。2.1.4异淀粉酶（脱支酶）异淀粉酶可以分解支链淀粉中的α-1,6-葡萄糖苷键，生成直链淀粉，碘反应由红变蓝。菌种：产气气杆菌ATCC9621，或产气气杆菌10016培养基：碳源：可溶性淀粉或薯干淀粉；氮源：豆饼粉、蛋白胨、酵母粉等。2.3蛋白酶目前全国蛋白酶的总产量约达2万吨，其中碱性蛋白酶占80％。2.3.1动植物来源蛋白酶动物来源：胰蛋白酶、胃蛋白酶（酸性蛋白酶）等植物来源：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等直接进行提取2.3.2微生物来源2.3.2.1酸性蛋白酶最适pH2.5-5.0，酸性蛋白酶中酸性氨基酸含量高，大多数在其活性中心含有2个Asp。菌种：黑曲霉、黑曲霉大孢子变种、根霉等，细菌极少培养基：豆饼粉、玉米粉、鱼粉等，除需要高浓度的有机氮外，还需添加1－3％的无机氮。蛋白胨对黑曲霉生产酸性蛋白酶有很强的诱导作用。2.3.2.2中性蛋白酶这是最早用于工业化生产的蛋白酶。最适pH7-8，大多数微生物中性蛋白酶是金属酶，一部分酶蛋白总含有一原子锌。菌种：枯草杆菌S114、1.398、172，栖土曲霉3.942，放线菌166，耐热解蛋白芽孢杆菌、灰色链霉菌、米曲霉。培养基：以葡萄糖、淀粉、饴糖、玉米粉、米糠、麸皮等为碳源，以豆饼粉、鱼粉、血粉、酵母等为氮源。固体培养或液体深层发酵。2.3.2.3碱性蛋白酶最适pH9.5-10.5，又称丝氨酸蛋白酶，广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，研究最为广泛和深入的是芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶。菌种：枯草杆菌、淀粉液化芽孢杆菌和短小芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌等少数几种。培养基：和中性蛋白酶类似。供洗涤剂添加的主要有卡斯柏格碱性蛋白酶。2.4纤维素酶纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一类酶的总称。国内外对纤维素酶有40多年的广泛研究，目前的研究表明，纤维素酶可分成两大类：碱性纤维素酶和酸性纤维素酶。我国纤维素酶未能工业化的主要困难：纤维素酶活力低，生产周期长，成本高，原材料分散，天然纤维材料难以被直接分解。纤维素酶的研究和应用需主要解决两个问题：一个是提高酶的活力，另一个是改变天然纤维素结构，提高它对酶作用的敏感性。酸性纤维素酶的产生菌种主要为细菌和丝状真菌，如绿色木霉（Trichodermaviride）、康氏木霉（Trichodermakonigii）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearthermophius）等。其中代表性的菌株有木霉、黑曲霉、变异青霉等，国内外对木霉纤维素酶的研究较多，但木霉一方面毒性嫌疑大，其应用受到限制；另一方面普遍存在着β-葡萄糖苷键活性低的缺陷，致使纤维二糖的积累，酶解效率下降。近年来，用黑曲霉作生产菌种收到了较好的效果。碱性纤维素酶的研究比较晚，但发展很快。1980年NOVO公司发现了在碱性范围有较高活性的腐植菌，通过液体发酵，成功地生产了洗涤剂用碱性纤维素酶，并很快得到应用。2.5脂肪酶目前生产上用的菌种是小