医学课件蛋白质结构与功能

第一节蛋白质的化学组成第二节蛋白质的分子结构第三节蛋白质结构与功能的关系第四节蛋白质的理化性质及其别离纯化第二章蛋白质结构与功能第一页，共一百三十二页。蛋白质的主要(zhǔyào)生理功能

蛋白质〔protein〕是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂(fùzá)的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最根本的命题。生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的表达者，具有以下主要功能：催化功能；结构(jiégòu)功能；调节功能；防御功能；运动功能；运输功能；信息功能；储藏功能第二页，共一百三十二页。碳(C)50%~55%氢(H)6%~8%氧(O)19%~24%氮(N)13%~19%~16%；N(g)×6.25=样品(yàngpǐn)Pr含量硫(S)0%~4%少量(shǎoliàng)的磷(P)、铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)和碘(I)等第一节蛋白质(protein)的化学组成元素组成第三页，共一百三十二页。生物体内的氨基酸类别(lèibié)

蛋白质氨基酸：蛋白质中常见的20种氨基酸稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述(shàngshù)20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还别离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨基酸。第四页，共一百三十二页。CαRH2NHCOOHCαRH3N+HCOO-或构成(gòuchéng)蛋白质的20种氨基酸(aa)的结构特点:1.均为L－α氨基酸，各种(ɡèzhǒnɡ)aa的R侧链各不相同2.α－碳原子上均连有一个(yīɡè)氨基(脯氨酸除外)3.α-碳原子为不对称(手性)碳原子(甘氨酸除外〕一氨基酸(aminoacid)——蛋白质的根本构成氨基酸结构通式第五页，共一百三十二页。〔一〕氨基酸的分类(fēnlèi)根据氨基酸侧链基团(Ｒ)的结构和理化(lǐhuà)性质，将其分为：1.非极性氨基酸2.极性氨基酸

酸性(suānxìnɡ)氨基酸

碱性氨基酸中性氨基酸第六页，共一百三十二页。1.非极性氨基酸包括(bāokuò)7个：甘氨酸〔Gly〕、丙氨酸〔Ala〕、缬氨酸〔Val〕、亮氨酸〔Leu〕、异亮氨酸〔Ile〕、苯丙氨酸〔Phe〕和脯氨酸〔Pro〕第七页，共一百三十二页。2.极性氨基酸R-基含有(hányǒu)极性基团；中性酪氨酸(Tyr)生理pH条件(tiáojiàn)下不解离。色氨酸(Trp)、丝氨酸(Ser)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、包括(bāokuò)8个：第八页，共一百三十二页。第九页，共一百三十二页。3.酸性(suānxìnɡ)氨基酸R-基有COOH(COO-)带负电荷第十页，共一百三十二页。4.碱性(jiǎnxìnɡ)氨基酸R-基有NH2(NH3+)赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)带正电荷第十一页，共一百三十二页。精氨酸〔Arg〕组氨酸〔His〕胍基咪唑(mīzuò)基第十二页，共一百三十二页。1.两性(liǎngxìng)解离及等电点〔二〕氨基酸的理化(lǐhuà)性质+OH+H++OH+H+pH<pIpH>pIpH=pI第十三页，共一百三十二页。等电点(pI)：氨基酸酸性(suānxìnɡ)解离和碱性解离的程度相等，分子所带的净电荷为零，此时溶液(róngyè)的pH值就称为该氨基酸的等电点。除碱性(jiǎnxìnɡ)氨基酸外，其余氨基酸的等电点均小于pH7pI=1/2〔pK1+pK2〕假设一个aa有3个解离基因，那么其pI为兼性离子两边pK的平均值第十四页，共一百三十二页。2.紫外吸收(xīshōu)性质色氨酸和酪氨酸在280nm波长(bōcháng)附近对紫外光有最大吸收峰。据此可以通过测定蛋白质溶液(róngyè)280nm的吸光值快速测定其蛋白质含量。3.茚三酮反响aa与水合茚三酮一起加热，生成蓝紫色的化合物，在570nm处有最大吸收。据此亦可用作aa含量分析。第十五页，共一百三十二页。构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收(xīshōu)光的能力。酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;第十六页，共一百三十二页。氨基酸与茚三酮反响(fǎnyìng)+3H20水合(shuǐhé)茚三酮(无色)NH3CO2RCHO+还原性茚三酮紫色化合物(弱酸)加热水合(shuǐhé)茚三酮+2NH3+还原性茚三酮第十七页，共一百三十二页。氨基酸与苯异硫氰酯〔PITC〕的反响(fǎnyìng)

〔Edman反响〕PITC〔phenylisothiocyanate〕+苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱硷中(400C)(硝基甲烷400C)H+第十八页，共一百三十二页。氨基酸与2,4一二(yīèr)硝基氟苯(DNFB)的反响

〔sanger反响〕DNFB〔dinitrofiuorobenzene〕DNP-AA(黄色)++HF弱硷中氨基酸第十九页，共一百三十二页。〔一〕肽与肽键(tàijiàn)脱去一分子水缩合(suōhé)形成的键二、肽一个(yīɡè)氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基肽键的概念：称肽键(peptidebond)第二十页，共一百三十二页。肽氨基酸借肽键(tàijiàn)相连而形成的化合物称肽(peptide)MetPhe二肽LysMetPhe三肽CysThrLysMetPhe五肽寡肽(oligopeptide)由10个以内(yǐnèi)氨基酸连成的小肽多肽(duōtài)(polypeptide)由许多氨基酸连成的肽又称多肽链或肽链其形状为一条没有分支的长链，氨基末端(Ｎ－端)羧基末端(C－端)CysMetPheLysSerThrValNH2COOH第二十一页，共一百三十二页。COHOCH3NH2HC+HOCOCH2NH2HC丙氨酸苯丙氨酸COHOCH3HCCH2NH2HC肽键(tàijiàn)NCOH二肽苯丙氨丙氨酸第二十二页，共一百三十二页。肽和肽键(tàijiàn)的形成肽单位(dānwèi)肽键(tàijiàn)肽平面第二十三页，共一百三十二页。在肽键(tàijiàn)中，与Ｃ－Ｎ相连的氧原子和氢原子呈反式构型〔反式〕〔顺式〕CNOHCNOH肽键(tàijiàn)的特点：第二十四页，共一百三十二页。肽键(tàijiàn)的特点：C—N单键(dānjiàn)为0.149nmC=N双键(shuānɡjiàn)为0.127nm具有局部双键性质不能自由旋转肽键中Ｃ－Ｎ键长为0.132nmCNOH第二十五页，共一百三十二页。氨基酸在形成肽链时丧失(diūsī)了一分子水，肽链中的氨基酸分子已不完整，氨基酸残基称为(chēnɡwéi)氨基酸残基(aminoacidresidue)。蛋白质与多肽(duōtài)的区别：Protein空间构象相对稳定氨基酸残基数较多Peptide空间构象不稳定氨基酸残基数较少第二十六页，共一百三十二页。〔二〕生物(shēngwù)活性肽1.谷胱甘肽(glutathione，GSH)构成(gòuchéng)第一个肽键的羧基是谷氨酸的γ－羧基由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)组成(zǔchénɡ)的三肽GluCysGly(1)组成(2)功能GSH是体内重要的复原剂第二十七页，共一百三十二页。谷胱甘肽

谷胱甘肽在体内参与氧化复原(huányuán)过程，作为某些氧化复原(huányuán)酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。第二十八页，共一百三十二页。

由下丘脑分泌(fēnmì)，其功能是促进腺垂体释放促甲状腺素(调节糖代谢)。2.促甲状腺素释放(shìfàng)激素(1)组成(zǔchénɡ)pyro-GluHisPro-NH2(2)功能焦谷氨酸组氨酸脯氨酰胺第二十九页，共一百三十二页。三、蛋白质的分类(fēnlèi)1.根据组成成分(chéngfèn)分为：单纯蛋白质——全部(quánbù)由aa组成；结合蛋白质——除蛋白局部外，还含非蛋白局部。结合蛋白质中的非蛋白局部称为辅基，常以共价键与蛋白局部相连。辅基：包括色素、寡糖、脂类、磷酸、金属离子、核酸等第三十页，共一百三十二页。2.根据(gēnjù)其形状分为：纤维(xiānwéi)蛋白质——分子状如纤维，其长轴比纵轴大于10：1球状蛋白质——分子(fēnzǐ)状如球形或椭圆形常难溶于水，常作为细胞支架和细胞连接，如大量存在于结缔组织中常可溶于水，如酶、转运蛋白、免疫球蛋白等第三十一页，共一百三十二页。第二节蛋白质的分子结构(fēnzǐjiéɡòu)一、蛋白质的一级结构(jiégòu)二、蛋白质的二级结构(jiégòu)三、蛋白质的三级结构四、蛋白质的四级结构高级结构或空间结构第三十二页，共一百三十二页。蛋

白

质

结

构

的

主

要

层

次一级结构(jiégòu)四级结构(jiégòu)二级结构(jiégòu)三级结构primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure超二级结构结构域

supersecondarystructureStructuredoman第三十三页，共一百三十二页。一、蛋白质的一级结构(jiégòu)蛋白质一级结构的概念：蛋白质分子中所有氨基酸的排列顺序(shùnxù)，称~一级结构中的主要化学键：肽键，二硫键氨基酸序列书写：以氨基末端开始~羧基末端结束，依次编1、2、3………第三十四页，共一百三十二页。蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序称为(chēnɡwéi)蛋白质的一级结构CysMetPheLysSerThrValNH2COOH第三十五页，共一百三十二页。胰岛素的一级结构各种蛋白质的根本差异在于(zàiyú)一级结构的不同第三十六页，共一百三十二页。一级结构(jiégòu)测定

根本战略：片段重叠法＋氨基酸顺序直测法要点：a.测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分

b.测定肽键的N－末端和C－末端

c.应用两种或两种以上(yǐshàng)的肽键内切酶分别在多肽键的专一位点上断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而得到一系列大小不等的肽段。

d.别离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序

e.将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。第三十七页，共一百三十二页。蛋白质顺序(shùnxù)测定根本战略

将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序

将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定二硫键拆开纯蛋白质第三十八页，共一百三十二页。二、蛋白质二级结构(jiégòu)概念：是指蛋白质分子中一段多肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及到aa侧链R基团的构象。肽单元〔肽平面(píngmiàn)〕：肽键的6个原子Cα1、C、N、O、H、Cα2位于同一平面，构成所谓的肽单元第三十九页，共一百三十二页。肽单位(dānwèi)第四十页，共一百三十二页。肽键(tàijiàn)中的Ｃ＝Ｏ和Ｃ－Ｎ均不能自由旋转肽键(tàijiàn)(-CONH-)中的４个原子２个α碳原子(Cα)和被约束在一个刚性平面(píngmiàn)〔即肽键平面(píngmiàn)〕上，构成一个肽单元(peptideunit)。第四十一页，共一百三十二页。酰胺平面(píngmiàn)与α-碳原子的二面角〔φ和ψ〕

二面角

两相邻酰胺平面(píngmiàn)之间，能以共同的Cα为定点而旋转，绕Cα-N键旋转的角度称φ角，绕C-Cα键旋转的角度称ψ角。φ和ψ称作二面角，亦称构象角。第四十二页，共一百三十二页。完全伸展(shēnzhǎn)的多肽主链构象α-碳原子酰胺平面(píngmiàn)Φ=1800，ψ=1800Φ=00，ψ=00的多肽(duōtài)主链构象酰胺平面Φ=00，ψ=00侧链非键合原子接触半径第四十三页，共一百三十二页。蛋白质的二级结构(jiégòu)类型α－螺旋(luóxuán)结构β－折叠(zhédié)结构β-转角无规卷曲第四十四页，共一百三十二页。〔一〕α－螺旋(luóxuán)(α－helix)由肽键(tàijiàn)平面盘旋形成的螺旋状构象1.概念(gàiniàn)第四十五页，共一百三十二页。2.α－螺旋(luóxuán)的结构特征(1)以肽键平面(píngmiàn)为单位,以α－碳原子为转折盘旋形成右手螺旋第四十六页，共一百三十二页。(2)每3.6个氨基酸残基绕成一个(yīɡè)螺圈(3600)螺距(luójù)为0.54nm每个氨基酸上升(shàngshēng)0.15nm肽键平面与中心轴平行第四十七页，共一百三十二页。(3)主链原子(yuánzǐ)构成螺旋的主体,侧链在其外部第四十八页，共一百三十二页。(4)肽键(tàijiàn)的CO和NH

都形成氢键是稳定(wěndìng)螺旋的主要作用力氢键的方向与中心(zhōngxīn)轴大致平行,第四十九页，共一百三十二页。〔二〕β－折叠(zhédié)

(β－pleatedsheet)故又称β－折叠(zhédié)片或β－片层。肽键平面呈伸展的锯齿状排列形成的结构(jiégòu)称β－折叠。常为两条或两条以上伸展的多肽链侧向聚集在一起形成扇面状，1.概念第五十页，共一百三十二页。2.β－折叠结构(jiégòu)特点(１)相邻肽键平面(píngmiàn)的夹角为1100

，呈锯齿状排列；侧链Ｒ基团交错地分布在片层平面(píngmiàn)的两侧。第五十一页，共一百三十二页。(３)由氢键维持稳定。其方向与折叠的长轴接近(jiējìn)垂直。(２)２～５条肽段平行排列构成(gòuchéng)，肽段之间可顺向平行(均从N-C)，也可反向平行。第五十二页，共一百三十二页。〔三〕β－转角(zhuǎnjiǎo)(β－turn)肽链出现1800回折的转角处结构称为(chēnɡwéi)β－转角。1.概念(gàiniàn)2.结构特征*第一个残基的C=O与第四个残基的N-H形成氢键.*常见于球状蛋白质分子外表.第五十三页，共一百三十二页。〔四〕无规卷曲(juànqǔ)(randomcoil)1.概念(gàiniàn)没有确定(quèdìng)规律性的肽键构象常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结构肽段之间起调节作用，有利于整条肽链盘曲折叠H2NCOOH第五十四页，共一百三十二页。无规那么卷曲(juànqǔ)细胞色素(sèsù)C的三级结构无规那么卷曲(juànqǔ)示意图第五十五页，共一百三十二页。(五)蛋白质的超二级结构(jiégòu)和结构(jiégòu)域

(2)结构域〔structuredomain〕蛋白质中相邻的二级结构单位〔即单个α－螺旋或β－折叠(zhédié)或β－转角〕组合在一起，形成有规那么的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构根本组合方式：αα；β×β；βββ在二级结构的根底上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样(zhèyàng)的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。形成意义：动力学上更为合理蛋白质〔酶〕活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性(１)超二级结构〔supersecondarystructure〕第五十六页，共一百三十二页。超二级结构(jiégòu)类型βββααβ×β12345

52341

Β-链βαββ-迂回(yūhuí)回形拓扑(tuòpū)结构回形拓扑结构β-迂回第五十七页，共一百三十二页。三蛋白质的三级结构(jiégòu)称为(chēnɡwéi)蛋白质的三级结构(trertiarystructure)1.概念(gàiniàn)一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布包含了主链构象和侧链构象的内容第五十八页，共一百三十二页。结构域(structuraldomain)一条肽链通过(tōngguò)盘曲折叠,常形成2个或多个在空间上可以明显区分的折叠实体，称为结构域.*类型(lèixíng)*概念(gàiniàn)全a-螺旋、a/β全β-折叠、无规那么卷曲第五十九页，共一百三十二页。卵溶菌酶的三级结构(jiégòu)中的两个结构(jiégòu)域-螺旋(luóxuán)-转角(zhuǎnjiǎo)-折叠二硫键结构域1结构域2第六十页，共一百三十二页。噬菌体T4全a-螺旋结构域磷酸丙糖同分异构酶a/β结构域第六十一页，共一百三十二页。由这些(zhèxiē)结构域缔合成具有三级结构的分子或亚基蛋白质三级结构(jiégòu)的意义：

蛋白质的三级结构(jiégòu)决定了蛋白质的生物学功能.第六十二页，共一百三十二页。疏水核：疏水区从位于分子内部，往往(wǎngwǎng)

是与辅酶/基或底物结合位点。维持蛋白质三级结构(jiégòu)稳定的因素亲水区：亲水区多位于分子(fēnzǐ)外表，故球形蛋白质水溶性较好。第六十三页，共一百三十二页。维持(wéichí)蛋白质分子构象的作用力

a.盐键b.氢键c.疏水键d.范得华力e.二硫键多肽链第六十四页，共一百三十二页。维系(wéixì)蛋白质结构的作用力1.肽键(tàijiàn)共价键2.二硫键共价键3.次级(cìjí)键非共价键维系蛋白质空间结构维系蛋白质一级结构维系蛋白质三级结构次级键的种类：氢键、疏水相互作用、离子键和范德华力第六十五页，共一百三十二页。氢键(qīnɡjiàn)负电性很强的原子〔如氧或氮〕和与氧或氮共价结合的氢原子相互吸引，这种作用力称为(chēnɡwéi)氢键。第六十六页，共一百三十二页。疏水相互作用由非极性基团(jītuán)受到水分子排斥相互聚集在一起的作用力疏水作用示意图第六十七页，共一百三十二页。离子键由异性电荷间的静电(jìngdiàn)吸引形成的键。第六十八页，共一百三十二页。

四蛋白质的四级结构(jiégòu)

(quaternarystructure)是指亚基间的空间排布、亚基间相互作用与接触部位的布局，不包括(bāokuò)亚根本身的空间结构。亚基间以次级键相连，绝无共价键。1.概念(gàiniàn)第六十九页，共一百三十二页。第七十页，共一百三十二页。蛋白质分子由两条或两条以上肽链组成，每条肽链各自形成了独立的三级结构，分子中的每一个(yīɡè)具有独立三级结构肽链,称为亚基亚基(subunit)2.维持(wéichí)蛋白质四级结构的作用力主要(zhǔyào)是疏水作用次级键盐键、氢键第七十一页，共一百三十二页。第三节蛋白质结构与功能(gōngnéng)的关系〔一〕一级结构是空间(kōngjiān)构象的根底一、蛋白质一级结构(jiégòu)与功能的关系

以124个氨基酸残基组成的牛胰核糖核酸酶〔4对二硫键〕为例说明第七十二页，共一百三十二页。牛胰核糖核酸酶的变性(biànxìng)与复性β-巯基乙醇尿素(niàosù)或盐酸胍透析有活性无活性第七十三页，共一百三十二页。1.一级结构相似(xiānɡsì)的蛋白质功能相似(xiānɡsì)一级结构不同的蛋白质功能不同胰岛素的一级结构(jiégòu)及种属差异〔二〕一级结构与功能(gōngnéng)的关系第七十四页，共一百三十二页。ACTH促肾上腺素皮质激素MSH

促黑激素(jīsù)一级结构(jiégòu)不同的蛋白质功能不同第七十五页，共一百三十二页。HbS与HbA的区别(qūbié)Β-亚基第6位氨基酸正常人：Glu患者(huànzhě)：Val第七十六页，共一百三十二页。正常(zhèngcháng)红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图镰刀形红细胞正常(zhèngcháng)红细胞-链N端氨基酸排列(páiliè)顺序12345678Hb-A〔正常人〕Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-S〔患者〕Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…第七十七页，共一百三十二页。第七十八页，共一百三十二页。不同(bùtónɡ)生物与人的Cytc的AA差异数目生物与人不同(bùtónɡ)的AA数目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、猪、羊、狗11马12鸡、火鸡13响尾蛇14海龟15金枪鱼21角饺23小蝇25蛾31小麦35粗早链孢霉43酵母44

第七十九页，共一百三十二页。不同生物(shēngwù)来源的细胞色素c中不变的AA残基

14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素细胞色素c分子的空间结构不变的AA残基35个不变的AA残基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持(wéichí)分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别〞并结合细胞色素复原酶和氧化酶。第八十页，共一百三十二页。例2由4个亚基组成(zǔchénɡ)血红蛋白(xuèhóngdànbái)功能(gōngnéng):运输O2第八十一页，共一百三十二页。二、蛋白质空间结构与功能(gōngnéng)的关系〔一〕肌红蛋白〔Mb〕与血红蛋白(xuèhóngdànbái)结构〔Hb〕蛋白质的空间结构决定(juédìng)生物学功能肌红蛋白〔1个亚基〕与血红蛋白〔4个亚基〕且一级结构有较大差异，但均具有与氧可逆地结合的能力。其结构特点是，都与血红素〔辅基〕共价结合第八十二页，共一百三十二页。第八十三页，共一百三十二页。O2第八十四页，共一百三十二页。血红蛋白输氧(shūyǎnɡ)功能和构象变化O2HbHb-O2O2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细血管中的PO2020406080100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin第八十五页，共一百三十二页。O2〔二〕血红蛋白(xuèhóngdànbái)构象变化与结合氧的能力第八十六页，共一百三十二页。变构效应(xiàoyìng)蛋白质分子与它的配体结合(jiéhé)后构象发生变化,其功能也随之变化(biànhuà)的现象,称为变构效应协同效应蛋白质分子中的1个亚基与其的配体结合后,能影响其它亚基与配体的结合,称为协同效应促进正协同效应抑制负协同效应第八十七页，共一百三十二页。血红蛋白(xuèhóngdànbái)与氧结合的正协同效应氧饱和度静脉血动脉血氧分压P50100%-HbMb第八十八页，共一百三十二页。第四节蛋白质的理化性质及其别离(fēnlí)纯化一、蛋白质的理化(lǐhuà)性质〔一〕两性(liǎngxìng)解离和等电点第八十九页，共一百三十二页。蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况(zhuàngkuàng)主要取决于溶液的pH值。PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2+OH-+H++OH-+H+pH=pIpH<pIpH>pI此时溶液(róngyè)的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。等电点〔pI〕：在某一pH值溶液(róngyè)中，蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零第九十页，共一百三十二页。蛋白质分子颗粒大小1~100nm之间,属胶体(jiāotǐ)颗粒范围，蛋白质的胶体(jiāotǐ)原因：外表(biǎomiàn)形成水化层外表同种电荷的斥力〔二〕蛋白质的胶体性质在溶液中能形成稳定的胶体第九十一页，共一百三十二页。〔三〕蛋白质的变性、沉淀(chéndiàn)与凝固1.蛋白质的变性(biànxìng)作用在某些理化因素(yīnsù)作用下，蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的变性作用(denaturation)。变性后的蛋白称为变性蛋白质。概念:第九十二页，共一百三十二页。常见(chánɡjiàn)的变性因素：强酸(qiánɡsuān)、强碱(qiánɡjiǎn)、有机溶剂、尿素、胍、重金属生物碱、化学因素物理因素剧烈振荡热、紫外线、超声波、第九十三页，共一百三十二页。变性蛋白质的主要(zhǔyào)特征:一级结构(jiégòu)不变。〔2〕生物(shēngwù)活性丧失。粘度增加而扩散系数减小。〔4〕变性蛋白质容易消化。〔1〕蛋白质分子中的次级键断裂，〔3〕变性蛋白质的溶解度常降低、构象破坏，但不涉及共价键的破坏，第九十四页，共一百三十二页。除去变性因素后，有的变性蛋白质又可恢复其天然构象和生物活性，这一现象(xiànxiàng)称为蛋白质的复性蛋白质的复性(fùxìnɡ)(renaturation)第九十五页，共一百三十二页。核糖核酸(hétánɡhésuān)酶变性与复性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis变性(biànxìng)复性(fùxìnɡ)第九十六页，共一百三十二页。当破坏了维持蛋白质胶体(jiāotǐ)稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。2.蛋白质的沉淀(chéndiàn)(pre-cipitation)概念(gàiniàn):应用:(1)蛋白质别离纯化(2)解毒(3)临床检验第九十七页，共一百三十二页。(1)盐析(yánxī)法(saltingout)向蛋白质溶液中参加大量中性盐使蛋白质沉淀称为(chēnɡwéi)盐析常用(chánɡyònɡ)的中性盐：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等使蛋白质沉淀的方法概念：特点：作用原理:盐离子与水亲和力极强，夺去蛋白质的水化层，减少分子间静电斥力第九十八页，共一百三十二页。(2)有机溶剂沉淀法使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电常数使蛋白质外表(biǎomiàn)电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀。

必须(bìxū)在低温下操作本卷须知:尽量缩短处理(chǔlǐ)的时间

及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去甲醇、乙醇、丙酮缺点：

原理:常用有机溶剂:常会使蛋白质变性第九十九页，共一百三十二页。重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电(fùdiàn)的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀。(3)重金属盐沉淀法此法常使蛋白质变性(biànxìng)失活。假设溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀(chéndiàn)更易发生缺点：原理:第一百页，共一百三十二页。生物碱试剂(shìjì)(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀。(4)生物碱试剂(shìjì)和某些酸类沉淀法反响(fǎnyìng)溶液的pH<pI，确保蛋白质以阳离子形式存在缺点：

原理:常引起蛋白质变性本卷须知:第一百零一页，共一百三十二页。3.蛋白质的凝固(nínggù)作用蛋白质的凝固(nínggù)作用实际上是蛋白质变性后进一步开展的不可逆结果。如加热(jiārè)可使蛋白质变为不再溶解的凝块。第一百零二页，共一百三十二页。(四)蛋白质主要(zhǔyào)呈色反响

双缩脲反响酚试剂反响→蛋白质定量、定性

茚三酮反响测定(cèdìng)常用方法

第一百零三页，共一百三十二页。双缩脲反响(fǎnyìng)

蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反响(fǎnyìng)，产生红紫色络合物红紫色络合物(硷性溶液(róngyè))Cu2+第一百零四页，共一百三十二页。

2.米伦氏反响酪氨酸的显色反响〔酚羟基反响〕米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，参加(jiārù)米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反响在蛋白质溶液中参加HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢参加，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反响〔吲哚环的反响〕鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸4.坂口反响精氨酸的反响〔胍基的反响〕精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠〔或次溴酸钠〕溶液中发生反响，产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸第一百零五页，共一百三十二页。5.福林试剂反响酪氨酸、色氨酸的反响〔复原反响〕福林试剂：磷钼酸-磷钨酸与双缩脲法结合---Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反响蛋白质-铜络合物，将福林试剂复原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍6.茚三酮反响灵敏度差7.黄蛋白反响浓硝酸(xiāosuān)与酪氨酸、色氨酸的反响生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反响呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高1---1000微克/毫升第一百零六页，共一百三十二页。〔五〕蛋白质的紫外吸收光谱(xīshōuɡuānɡpǔ)

蛋白质在远紫外光区〔200-230nm〕有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量(dìngliàng)鉴定。蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260测定(cèdìng)范围：0.1～0.5mg/ml第一百零七页，共一百三十二页。二、蛋白质的别离(fēnlí)纯化(一)盐析(yánxī)和有机溶剂沉淀(二)电泳(diànyǒnɡ)(三)透析和超滤(四)层析(五)超速离心第一百零八页，共一百三十二页。分类：根据支持物的不同，电泳(diànyǒnɡ)电泳(diànyǒnɡ)可分为：薄膜电泳、凝胶电泳。〔二〕电泳概念：带电颗粒在电场中向着所带电荷相反(xiāngfǎn)

方向移动称为电泳。原理：不同的蛋白质的因结构、形状和带电量的不同而有不同的泳动速度(sùdù)，从而到达分析和别离蛋白质的目的。应用：电泳技术是生化常用分析技术之一第一百零九页，共一百三十二页。利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过(tōngguò)超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在膜上，称为超过滤。将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于流动的适当的缓冲液〔如纯水〕中，小分子杂质(zázhì)〔如硫酸铵、氧化钠等〕从袋中透出，而蛋白质保存于袋中从而将蛋白质纯化，这种方法称为透析。〔三〕透析第一百一十页，共一百三十二页。透析工作(gōngzuò)图半透膜原理(yuánlǐ)第一百一十一页，共一百三十二页。层析种类：凝胶过滤(guòlǜ)〔分子筛〕离子交换层析〔阴离子和阳离子〕亲和层析(四)层析(cénɡxī)第一百一十二页，共一百三十二页。带正电荷多蛋白紧密结合带负电荷多蛋白流过层析柱阳离子交换(jiāohuàn)树脂工作示意图第一百一十三页，共一百三十二页。分子筛层析(cénɡxī)第一百一十四页，共一百三十二页。〔五〕第一百一十五页，共一百三十二页。亲和层析工作(gōngzuò)示意图蛋白质载体(zàitǐ)介质配体结合(jiéhé)洗脱洗脱介质第一百一十六页，共一百三十二页。(六)超速离心第一百一十七页，共一百三十二页。三、多肽链中氨基酸的顺序(shùnxù)分析第一步：别离提纯蛋白质，测定NH2末端的数目(shùmù)，确定蛋白质分子是由几条肽链构成的，并别离出每条肽链。测定肽链的分子量,计算组成该肽链的氨基酸残基数。及每种aa的百分组成。一般(yībān)过程：肽链分子中氨基酸残基数=肽链的分子量÷120

〔各种的氨基酸残基的平均分子量为120〕再将肽链彻底水解，用离子交换层析法将各种的氨基酸别离。第一百一十八页，共一百三十二页。a.丹磺酰氯法丹磺酰氯是一种强荧光剂，它能专一地与链N-端α-氨基反响生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光，可直接(zhíjiē)用电泳法或层析法鉴定出N-端是何种氨基酸。第二步测定(cèdìng)肽链的氨基末端和羧基末端1.N末端(mòduān)的测定b.二硝基苯氟法：过时，不用第一百一十九页，共一百三十二页。2.C末端(mòduān)的测定常用(chánɡyònɡ)羧基肽酶法

羧基肽酶专一地将肽链水解成片断(piànduàn)，分别进行顺序分析。第一百二十页，共一百三十二页。第三步肽链的局部(júbù)水解胰蛋白酶(yídànbáiméi)的作用原理1.酶解法(jiěfǎ)第一百二十一页，共一百三十二页。CNBr与Met反响测定(cèdìng)Pr的一级结构2.化学法第一百二十二页，共一百三十二页。层析鉴定就可N-端开始(kāishǐ)确定被测肽段的氨基酸排列顺序第四步肽段氨基酸顺序(shùnxù)分析一般(yībān)采用Edman降解法弱碱条件异硫氰酸苯酯+N端α-氨基苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽〕酸性条件环化水解苯乙内酰硫氨基酸(PTH-aa)失去原N-端氨基酸的肽剩下的肽可反复进行上述处理，依次生成各种PTH-aa，第一百二十三页，共一百三十二页。Edman降解(jiànɡjiě)法的示意图第一百二十四页，共一百三十二页。