DB44T 868-2011灵芝（赤芝）菌种

灵芝(赤芝)菌种2011-04-11发布2011-07-15实施1灵芝(赤芝)菌种本标准适用于灵芝(赤芝)固体菌种。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂NY/T528食用菌菌种生产技术规程完整，无损，无色透明干燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求试管总容积的五分之一至四分之一顶端距棉塞或硅胶塞40mm～50mm接种块大小(接种量)长满斜面菌丝白色、浓密、短绒状，气生菌丝有但不茂盛。在接种块附近的菌丝有时呈浅黄色。2表1(续)均匀、平展、无角变、无高温抑制线无浓密、丰满、旺健，长速正常、整齐，菌丝有较多锁状联合。不得检出完整，无损接种量(每支母种接原种数，接种物大小)4瓶(袋)～6瓶(袋),≥(12mm×15mm)3表3(续)均匀、平展、无角变、无高温抑制线、均匀紧紧贴瓶(袋)壁、无干缩无无无无量每袋200g干料为例),在避光、适温(25℃±1℃)条件下，菌丝长速为8.0mm/d±0.8mm/d,菌丝完整，无损干燥、洁净、松紧适度，满足透气和滤菌要求接种量[每瓶(袋)原种接栽培种数]30瓶(袋)～50瓶(袋)长满培养料菌丝白色、浓密、短绒状生长齐整，色泽一致，无角变，无高温抑制线紧贴瓶(袋)壁、无干缩无无无在瓶(袋)口附近允许有小块原基出现有灵芝菌种特有清香味，无酸、臭、霉等异味4在适宜培养基上、适宜培养容器里(以附录A.2.3为配方、使用17cm×34cm聚量每袋400g干料为例),在避光、适温(25℃±1℃)条件下，菌丝长速为6.7mm/d±0.8mm/d,菌丝表5感官要求检验方法检验项目检验项目肉眼观察母种、原种肉眼观察、测量栽培种肉眼观察培养基上表面距瓶(袋)口的肉眼观察菌种外观各项(杂菌菌落除外)肉眼观察肉眼观察，必要时用5×放大肉眼观察用放大倍数不低于400倍的光学显微镜对培养物的水封片进行观察，每一检样应观察不少于50个视℃~38℃避光震荡培养1d,观察培养液是否混浊。培养液混浊，为有细菌污染；培养液澄清，为无细28℃避光培养3d～4d,出现白色以外色泽的菌落或非灵芝菌丝形态菌落的，或出现异味者5检验项目检验项目母种长满所需时间(d)原种长满所需时间(d)菌丝长满培养基料面所需时间(d)总生物学效率(%)出第一潮菇所需时间(d)第一潮菇生物学效率(%)芝形平均单产(g/袋)芝盖尺寸(mm)各级菌种都要留样备查，留样的数量应每个批号菌种3支(瓶、袋)～5支(瓶、袋),于避光、4菌种量的10%、5%、1%。但每批抽样数量不得少于10支(瓶、袋);若一级抽样超过100支(瓶、袋)66.2判定规则每支(瓶、袋)菌种应贴(印)有清晰注明以下内容的标签：a)产品名称(如：灵芝母种);b)品种名称(如：赤芝02);c)生产单位(如：×x菌种厂);每箱(或其它包装单位)菌种必须贴有清晰注明以下要素的包装标签：7外包装可采用洁净、干燥的塑料箱、编织袋或有足够强度的纸箱，箱7.3.2气温达30℃或以上时，需用4℃~15℃冷藏车运输，运输时间不得超过7d。7.3.3运输中必须有防震、防晒、防尘、防雨淋、防冻、用于转管保藏的母种，在4℃~6℃避光保藏不超过6个月；母种至使用时，在4℃~6℃避光保藏不超过90d;至销售时，在4℃~6℃避光保藏不超过80d。原种应尽快使用，在温度不超过30℃、清洁、干燥、通风(空气相对湿度50%～70%)、避光的室内存放不超过7d,在4℃~6℃下贮存时，贮存期不超过30d。栽培种应尽快使用，在温度不超过30℃、清洁、干燥、通风(空气相对湿度50%～70%)、避光的室内存放不超过7d,在4℃~6℃下贮存时，贮存期不超过30d。8(资料性附录)灵芝母种、原种及栽培种常用培养基及其可选配方A.1灵芝母种常用培养基及其可选配方A.1.1PDA培养基(1000mL)马铃薯(去皮)200g,葡萄糖20g,琼脂20g,水1000mL,pH自然。A.1.2综合PDA(CPDA)培养基(1000mL)马铃薯(去皮)200g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁0.5g,琼脂20g,维生素B:20μg,水A.2灵芝原种和栽培种常用培养基及其可选配方A.2.1颗粒培养基高粱80%、小米19%、轻质碳酸钙1%。高粱用水煮熟至掰开无白心，沥去多余水分；小米使用前浸泡12小时，沥去多余水分；高粱、小米和轻质碳酸钙三者混合拌匀，pH自然。A.2.2棉籽壳培养基棉籽壳80%、麦麸19%、轻质碳酸钙1%。三者混合拌匀，加水至培养料含水量达60%～65%,pH自然。A.2.3阔叶木杂木屑培养基阔叶木杂木屑78%、麸皮20%、轻质碳酸钙2%。三者混合拌匀，加水至培养料含水量达60%～65%,9(资料性附录)待测菌种CYM液体培养基配方：蛋白胨2g,酵母膏2g,葡萄糖20g,硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g,磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1g,纯水1000mL,pH自然。a)2倍CTAB提取液在65℃在水浴锅中预热。c)样品转入1.5ml离心管中，管内先加入600μL2倍CTAB提取液在65℃水浴锅中预热(用少量提取液洗下研钵上残留的粉末样品，轻轻混匀，在65℃中水浴3minmind)冷却2min后，加入等体积(约600μL)的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),充分摇动混匀。e)以约11000×g,离心10min,取上清液移入另一新1.5ml离心管，重复步骤d)操作，用氯仿/异戊醇(24:1)再抽提离心一次。同时将2/3体积的异丙醇(或2倍体积的无水乙醇)预冷。f)两次抽提后的上清液转入新离心管，加入2/3体积的预冷异丙醇(或2倍体积的预冷无水乙醇),再加入约1/10体积的乙酸钠(约30μL～50μL),缓慢翻转混匀，沉淀DNA。g)以约18000×g,离心15min,弃上清液。70%酒精(400μL)漂洗沉淀2次(快速翻转振荡几分钟),以约7000×g,离心5min,弃上清液，沉淀用纸巾吸取剩余乙醇，自然晾干或低温烘干(电风筒吹干)。h)加1倍TE缓冲液(Tris10mmol/L+EDTA1mmol采用真菌核糖体基因间隔区通用引物对ITSITSITSTCCGTAGGTGAACCTGCGGITS反应条件：94℃预变性5扩增产物回收纯化后，以PCR引物为测序引物，分别双向序列拼接后在GenBank上进行比对(Blast),若发现序列与GenBank上已知序列方向相反，则列相似性达98%以上时，则可判定待测菌与GenBank上该已知菌是同一个种。取赤芝(Gl-YW)为灵TCGAGTTTTGACCGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGTGCACGCCACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTGCGAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTTCTGTGCCTGCGTTTATCACAAACTCTATAAAGTAACAGAATGTGTATTGCGTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGA