微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察

微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第1页1-1试验一显微镜使用及微生物形态观察

一.目标

1.了解普通光学显微镜结构，学习显微镜使用方法和保养。（高、低倍镜使用）

2.观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌个体形态，学会生物图绘制。二.试验器材

1.光学显微镜

2.示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第2页1-2三.试验内容(一)显微镜结构和使用方法1.结构机械个别:镜筒(双筒，两筒间距离可调，上装有目镜）转换器（3孔，装有物镜）载物台（中央圆孔、弹簧夹、移动器）调整器（粗调、细调）镜臂（支撑作用）镜座（上有光源，亮度可调）光学个别：目镜（10×、16×）物镜（低倍镜10×、高倍镜40×、油镜100×）聚光器（内有光圈调整）光源（光量可调）

微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第3页1-3

显微镜放大倍数=目镜放大倍数×物镜放大倍数

物镜上标识：

1.25(0.65、0.25)100(40、10）

160/0.17

↓↓↓↓

数值孔径放大倍数镜筒长盖玻片厚度

数值孔径：N.A.=n﹒sinα/2

n—

玻片和物镜之间折射率。

α—

光线最大射入角。

分辨率（最大可分辨距离）＝λ/N.A.

λ—波长

微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第4页1-4

2.显微镜使用

低倍镜使用

（1）双手取出显微镜置于试验台上，接上电源，打开开关，调整适当光量。

（2）转动转换器，将低倍镜移至正下方。调整两目镜镜筒间距离。

（3）将载玻片放在载物台上夹住，移动观察对象于圆孔正中。

（4）侧视物镜，转动粗调将载物台上移，至载玻片距物镜头约５ｍｍ时停顿。

（5）双眼向目镜里观察，同时旋转粗调整器使载物台迟缓下移，若标本显出但不清楚，可用细调整器调至清楚。若粗调旋转太快，超出焦点没有看到标本，则必须重复（4）、(5)步骤。不能在眼睛观察目镜同时旋转粗调，以防物镜与载玻片相碰撞，造成损坏。

微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第5页1-5

高倍镜使用

在用低倍镜找到观察目标后，若需要深入放大观察，将其移到视野中央。用转换器将高倍镜移到镜筒下方，将光量调大一点。若标本不清楚，用细调上下转动使之清楚。（此时不再动粗调）

３．显微镜维护

（１）将载物台降至最低，取下标本片。

（２）将光量调至最小，关上电源。

（３）用镜头纸先檫目镜、物镜，再擦显微镜其它个别。

（４）将显微镜放入镜箱，还原。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第6页1-6（二）微生物形态观察

1.

用低倍镜和高倍镜观察颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、星藻示范片。

2.

画出微生物形态图，并标显著微镜放大倍数。10╳10

颤藻微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第7页2-1试验二活性污泥生物相观察

一.目标

1.学习测量微生物大小。

2.学习用压滴法制作标本片。

3.观察几个原、后生动物，菌胶团及藻类个体形态。

二.试验器材

1.活性污泥混合液。

2.单胞藻、新月藻、草履虫等示范片。

3.显微镜、载玻片、盖玻片。

4.目测微尺、物测微尺。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第8页2-2

三.试验内容1.微生物大小测定(1)标定目镜测微尺装在目镜上目测微尺中央刻有等分为100格或更多格标尺，使用前要用物测微尺标定。物测微尺中央刻有1mm长标尺，等分为100格，10μm／格。将物测微尺刻度朝上放在载物台上，用低倍镜找出物测微尺刻度，移动物测微尺使其第一条线与目测微尺第一条线重合，顺着刻度线找出另一条重合线。算出低倍镜下目测微尺每格长度。换高倍镜用一样方法标定出高倍镜下目测微尺每格长度。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第9页2-3测微尺示意图(2)微生物大小测量

将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物镜测量微生物长度和宽度占目测微尺格数，再按目测微尺1格长度算出微生物长度和宽度。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第10页2-4

2.压滴法观察活性污泥中生物相

（1）压滴法制作标本片用滴管取活性污泥混合液一小滴，放在载玻片中央。取一块盖玻片先将一边与混合液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在混合液上。片内不能有气泡。（2）观察活性污泥中生物相先用低倍镜观察活性污泥中菌胶团、原生动物、后生动物。画出所观察到生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物大小。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第11页2-5

四.试验结果

1.低、高倍镜下目测微尺每格长度。

2.画出2~3种污泥中所观察到生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物大小。

3.画出两种藻类生物形态图，标明名称、放大倍数和微生物大小。。3.观察几个藻类个体形态观察几个藻类个体形态，画出生物形态图，标明名称、放大倍数。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第12页3-1试验三微生物染色

一.目标

1.学习微生物染色技术，掌握微生物单染色法和革兰氏染色法。

2.学习油镜操作。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第13页二．染色原理和油镜工作原理1．油镜工作原理

油镜放大倍数最大（100），故镜头焦距短，直径小,但所需光照强度却最大。从标本片透过光线是从玻片进入空气，再进入镜头。因为玻璃和空气介质密度不一样，有些光会因折射或反射而不能进入镜头。物象就显现不清。为了不使经过光线有所损失，须在油镜与玻片之间加入折射率和玻璃

(n=1.52）相仿香柏油

(n=1.515)。故而称之为“油镜”。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第14页3-2

2．单染色法：微生物不但个体微小，且无色半透明。要在显微镜下观察清楚，必须染上颜色。微生物细胞中含有大量蛋白质等一类两性电解质：在酸性溶液中结合质子带正电；在碱性溶液中给出质子而带负电。等电点普通在pH=2~5。所以，在中性、碱性或弱酸性溶液中，微生物细胞通常带负电荷。碱性染料在电离时，染色个别是带正电荷，轻易与带负电荷菌体结合使之着色。经染色后菌体细胞与背景形成鲜明对比，在显微镜下很轻易观察。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第15页3-3

3．革兰氏染色法：

革兰氏染色法将细菌分为G＋和G-

，这由两类细菌细胞壁结构和组成不一样而决定。用结晶紫初染后，全部细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘复合物，增强了染料与菌体结协力。用乙醇脱色处理时，两类细菌脱色效果是不一样。G＋细菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染依然保持初染剂蓝紫色。G-细菌则不一样，因为其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫—碘复合物比较轻易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂颜色。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第16页3-4

三．试验器材

1．显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。

2．结晶紫染液、碘液、95%乙醇、沙黄染液。

3．菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第17页3-5四．试验内容

(一)单染色

1．涂片取一块载玻片，用记号笔划分出两区域并做上记号，在两区域中央各滴半滴无菌水，用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中，和匀后涂成薄膜。

2．干燥室温自然干燥或吹干。

3．固定涂面朝上，经过火焰2~3次。

4．染色在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之覆盖2分钟。

5．水洗傾倒去染液，斜置载玻片，用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。

6．干燥室温自然干燥或用吸水纸吸干。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第18页3-6

(二)革兰氏染色

完成单染色1~6步骤后

7.媒染加媒染剂碘液使之覆盖1分钟，水洗，吸水纸吸干。

8.脱色滴加95%乙醇数滴使之覆盖16秒钟，马上水洗,吸干。

9.复染用沙黄（番红）液复染2分钟，水洗，吸干。

微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第19页(二)镜检

先分别用低倍镜和高倍镜找到要观察样品区域后，用转换器将物镜转到空挡，在样品区域滴加香柏油，再将油镜慢慢转到工作位置浸入油中。若不清楚，慢慢转动微调直至清楚。油镜用完后，用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液檫拭油镜头。再用干镜头纸檫干镜头。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第20页3-7

五．试验结果

观察两种细菌形态和颜色，绘出油镜下细菌形态图，说明革兰氏染色结果。

六．思索题

经过试验，你认为革兰氏染色成功关键是那一步？为了防止假阳性或假阴性出现，在对未知菌种做革兰氏染色判定时，你认为应该怎样做？微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第21页4-1试验四微生物计数

（显微镜直接计数法）

一．目标

1.了解血球计数板计数原理，掌握血球计数板计数方法。

2.观察酵母菌形态，学习区分酵母菌死活细胞方法。二.试验器材

显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、盖玻片。

微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第22页4-2

三．原理

1.血球计数板计数原理血球计数板是一块特制载玻片，有四条竖槽和一条横槽。横槽两边平台上各有一个有九个大方格方格网，中间大方格为计数室：边长为１ｍｍ，深为0.1mm，容积为0.1mm3(10-4ml)。计数室有两种规格：一是分为16个中方格，每中方格中有25个小方格；另一个是分为25个中方格，每中方格有16个小方格。两种都共有400个小方格。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第23页4-3

计数：

数出5个中方格中总菌数A，若菌液稀释倍数为B，则计算公式以下：

(1)25个中方格计数板计算公式

(2)16个中方格计数板计算公式微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第24页

2.区分酵母菌死活细胞基础原理美蓝是一个无毒性染料，它氧化型呈蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌活细胞进行染色时，因为细胞新陈代谢作用，细胞内含有较强还原能力，能使美蓝由蓝色氧化型变成无色还原型。所以，含有还原能力酵母活细胞是无色或淡蓝色，而死细胞或代谢作用衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌死细胞和活细胞进行判别。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第25页

四.试验内容

1.酵母菌形态观察及死活细胞判别

(1)在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。

(2)将标本片放3分钟后，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并依据颜色来区分死活细胞。

微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第26页4-4

2.酵母菌液计数

(1)镜检计数室对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后才能进行计数。

(2)加样品

在血球计数板上盖上盖玻片,用滴管将摇匀酵母菌液由盖玻片边小槽滴一小滴,菌液会自动进入计数室，静置5分钟。

(3)计数将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室位置，再换高倍镜计数。每计数室计5个中格（四角和中间）。计数标准：计上不计下，计左不计右。芽体占母细胞二分之一时算一个。

(4)清洗血球计数板

计数后将血球计数板用自来水冲洗洁净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不洁净，则必须重复洗涤洁净为止。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第27页4-5

五.结果统计

1.2.酵母菌死活细胞百分比？六.思索题用此法计数结果是活菌体还是死、活菌体总和？微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第28页5-1试验五活性污泥不一样微生物种群分离培养与判别

一.目标

1．掌握配制培养基和制备无菌水方法。

2.学会玻璃器皿干热灭菌和培养基高压蒸汽灭菌技术。

3.学习倒平板方法和两种分离微生物基础操作技术。

4.学习微生物纯种分离、培养及菌落观察。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第29页

二.试验器材1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。

2.牛皮纸等包扎材料。

3.10%HCl、10%NaOH、精密pH试纸。

4.牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂。

5.高压蒸汽灭菌锅等。

6.活性污泥。

7．接种环、酒精灯、恒温箱(培养箱)等。

8．结晶紫染液。

9.显微镜、载玻片微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第30页5-2

三.试验内容

（一）培养基制备及灭菌1.玻璃器皿包扎与灭菌（1）六套培养皿一组,用报纸包装。（2）取四支吸量管，在其吸端塞少许棉花后用长报纸条包扎。（3）干热灭菌:上述玻璃器皿在160°C烘箱内2小时。

2.无菌水制备在3支试管中各装入9ml自来水，塞上硅胶塞,同下述培养基一起用高压蒸汽灭菌。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第31页5-33.培养基制备

⑴称量：牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂自来水

0.75g1.5g0.75g3g150ml

⑵

溶化：用烧杯在电炉上将上述各物依次溶解，注意补充水。

⑶调pH值：

溶液稍冷后用pH试纸、10%NaOH或10%HCl

调整溶液pH在7.6左右。

⑷

分装：试管4支各装其高度1/5溶液，其余溶液装锥形瓶。

⑸加塞包扎：锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。

⑹湿热灭菌：（高压蒸汽灭菌）1.05kg/cm2(103kPa)、

121℃灭菌20min。

⑺

搁置斜面：

试管培养基冷至50℃时斜搁使斜面长度不`

超出试管二分之一。微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察第32页6-1（二）微生物分离、培养及形态观察1.平板划线分离法

(1)倒平板:将融化并冷至50℃细菌培养基倒约15~20ml于无菌培养皿中，马上