亲和色谱和超临界流体色谱演示文稿

亲和色谱和超临界流体色谱演示文稿目前一页\总数九十一页\编于十一点亲和色谱和超临界流体色谱目前二页\总数九十一页\编于十一点概述生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。静电作用、氢键等多种作用力对亲和作用具有影响。生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲和作用。在众多亲和分离技术中，亲和色谱是应用最多，分离效果最好的技术。目前三页\总数九十一页\编于十一点常见亲合作用体系特异性亲和体系高特异性抗原-单克隆抗体荷尔蒙－受体蛋白核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白酶－底物、产物、抑制剂群特异性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－辅酶凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质-肝素酶、蛋白质-活性色素（染料）酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）目前四页\总数九十一页\编于十一点目前五页\总数九十一页\编于十一点1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、pH：在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其它pH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、ClO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失影响亲和作用的因素目前六页\总数九十一页\编于十一点利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分离的技术为亲和分离技术亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用的物质目前七页\总数九十一页\编于十一点8找与底物专一可逆结合的配基；将配基通过共价键偶联到基质；配基与底物吸附；洗脱目标物。

目前八页\总数九十一页\编于十一点9亲和纯化技术亲和层析(Affinitychromatography)亲和过滤（膜分离）亲和分配（双水相萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和沉淀（沉淀）亲和电泳（电泳）目前九页\总数九十一页\编于十一点配基生物特异性配基拟生物亲和配基亲和配基必须具备的条件：1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的2、结合常数要适当3、稳定性好，可进行化学改性目前十页\总数九十一页\编于十一点专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度目前十一页\总数九十一页\编于十一点亲和配基的分类单专一性的小分子配基基团专一性的小分子亲和配基专一性的大分子亲和配基免疫亲和配基基团专一性的大分子亲和配基目前十二页\总数九十一页\编于十一点亲和配基的选择组合化学肽库选择亲和配基目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序列噬菌体展示技术目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克隆群体→氨基酸序列SELEX技术随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选目前十三页\总数九十一页\编于十一点亲和洗脱目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。目前十四页\总数九十一页\编于十一点亲和色谱亲和层析(AffinityChromatography，AC)是利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。是亲和分离技术中最具优势的方法目前十五页\总数九十一页\编于十一点含配体溶液收集目的蛋白

洗下未结合的蛋白混合蛋白样品平衡液带有配体的树脂珠（或胶粒）目前十六页\总数九十一页\编于十一点目前十七页\总数九十一页\编于十一点亲和层析的基本特点1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3、纯化倍数大，产物纯度高4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件5、价格相对较昂贵；6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。目前十八页\总数九十一页\编于十一点基质的选择理想的基质应符合下面的要求：1．极低的非特异性吸附。2．高度的亲水性。3．较好的理化稳定性。4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。5．适当的多孔性。一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。亲和色谱介质的制备目前十九页\总数九十一页\编于十一点配基的选择

根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specificligand）和通用性配体（generalligand）。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。

目前二十页\总数九十一页\编于十一点

通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。

目前二十一页\总数九十一页\编于十一点22配基的浓度

对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。增加亲和柱的长度来提高吸附率。配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。理想的配基浓度为1-10μmol/L。目前二十二页\总数九十一页\编于十一点23配基偶联的位置配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。目前二十三页\总数九十一页\编于十一点24配基分子的大小

选用大分子配基。小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。目前二十四页\总数九十一页\编于十一点亲和吸附介质的配基

（1）酶的抑制剂一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。目前二十五页\总数九十一页\编于十一点

（2）抗体利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinitychromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。

目前二十六页\总数九十一页\编于十一点

（3）A蛋白

A蛋白（proteinA）为分子量约42KD的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约5％。A蛋白在确定其为蛋白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白G(immunogloblinG，IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部分）

A蛋白不仅与抗体（IgG）的抗原结合部位结合，而且任何抗体的Fc片断的结构都非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。目前二十七页\总数九十一页\编于十一点

（4）凝集素

凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA，conA)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作用较强，而麦芽糖凝集素（wheatgermagglutinin，WGA）与N-乙酰葡糖胺（N-acetyl-glucosamine）的亲和结合作用较强。

目前二十八页\总数九十一页\编于十一点

（5）辅酶和磷酸酰苷各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadeninedinucleotide，NAD）、辅酶Ⅱ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADphosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2’，5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶的亲和配基。目前二十九页\总数九十一页\编于十一点

（6）过渡金属离子

Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electrondonoratom）产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+。目前三十页\总数九十一页\编于十一点

（7）组氨酸在各种氨基酸中，组氨酸的性质比较独特：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。目前三十一页\总数九十一页\编于十一点

（8）肝素

肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5～30KD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低。目前三十二页\总数九十一页\编于十一点活化

基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。

溴化氰活化法

溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下：

介质活化与耦联目前三十三页\总数九十一页\编于十一点

这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。

目前三十四页\总数九十一页\编于十一点环氧基活化法在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。目前三十五页\总数九十一页\编于十一点

这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的N－C、O－C和S－C键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH为9-13，温度为20-40℃。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。上面两种方法是比较常用的方法。另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法。目前三十六页\总数九十一页\编于十一点亲和配基耦联密度测定耦联密度决定了介质的吸附容量分光光度法量差法分析水解作用分析元素分析法目前三十七页\总数九十一页\编于十一点间臂分子当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。目前三十八页\总数九十一页\编于十一点加入间臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易由疏水性非特异吸附造成弯曲，反而降低吸附效率。间臂的疏水性也需要考虑，应尽量减小对配基的影响。如间臂和配基疏水性较强，则效果不明显。目前三十九页\总数九十一页\编于十一点目前四十页\总数九十一页\编于十一点常见的亲和色谱核苷酸及辅酶亲和色谱固定化金属离子亲和色谱染料亲和色谱免疫亲和色谱基团专一性大分子亲和色谱目前四十一页\总数九十一页\编于十一点核苷酸及辅酶亲和色谱指将核苷酸（或辅酶）作为亲和配基固定在色谱介质上进行亲和色谱的技术，主要利用核苷酸特别是辅酶因子和蛋白质之间的专一性识别达到分离纯化目的目前四十二页\总数九十一页\编于十一点目前四十三页\总数九十一页\编于十一点介质制备碳二亚胺直接法偶联溴化氢活化琼脂糖→连接氨基己酸→加入核苷酸→溶液中保存→洗涤→偶联间接偶联法间臂分子和核苷酸→活化的介质目前四十四页\总数九十一页\编于十一点吸附和解吸选择合适的缓冲液条件下吸附一般采用辅酶或盐溶液进行梯度洗脱目前四十五页\总数九十一页\编于十一点固定化金属离子亲和色谱蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白质与固定化金属离子结合，从而达到分离的目的。金属离子如锌和铜。目前四十六页\总数九十一页\编于十一点47将活化的介质与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。金属螯合剂：亚氨二醋酸、氨基水杨酸、8-羟基喹啉、羧甲基氨基酸等。目前四十七页\总数九十一页\编于十一点亲和作用机理静电作用配位键结合共价键产生π键目前四十八页\总数九十一页\编于十一点吸附采用50mmol/L的金属盐溶液通过色谱柱，直至色谱介质吸附饱和。平衡缓冲溶液洗去未螯合的金属离子加入适宜浓度的NaCl和选择合适pH值有利于减少非特异性吸附。目前四十九页\总数九十一页\编于十一点解吸吸附蛋白质解吸的方法：改变pH值竞争性洗脱采用50-100mmol/L的EDTA洗脱，可将蛋白质和金属离子解吸，洗涤，重新上柱平衡，固定所需的金属离子。目前五十页\总数九十一页\编于十一点pH与氯化铵浓度的影响目前五十一页\总数九十一页\编于十一点固定化亲和离子色谱的应用基因修饰蛋白质的纯化遗传修饰→具亲和尾蛋白→色谱分离→亲和尾切除→色谱分离酶切位点亲和尾大小目前五十二页\总数九十一页\编于十一点53染料亲和色谱有机染料具有类似于NAD+的结构。需核苷酸类物质为辅酶的酶，对染料具有一定亲和力。染料共价偶联到琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱。染料亲和层析已成功的分离纯化了多种酶。目前五十三页\总数九十一页\编于十一点目前五十四页\总数九十一页\编于十一点染料亲和色谱介质的制备配基性质、染料结构和染料取代度是制备过程中需要考虑的主要因素。以下途径可以实现制备：采用琼脂糖凝胶，染料连接在-OH上，该过程可在一定条件下直接完成。染料也可通过活性基团和基质偶联，该方法可引入高密度的染料。目前五十五页\总数九十一页\编于十一点吸附蛋白质量增多选择亲和作用力较小的染料有利于解吸目前五十六页\总数九十一页\编于十一点吸附与解吸采用磷酸盐缓冲液，在条件下吸附常用解吸方法：增加盐浓度改变pH值采用水溶性高聚物亲和洗脱最后对杂蛋白进行变性处理，洗涤、缓冲液平衡再生介质。目前五十七页\总数九十一页\编于十一点免疫亲和色谱抗原和抗体的作用具有高度的专一性,并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到吸附剂上,便可有效地分离和纯化免疫物质。特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲和配基不稳定，容易降解。目前五十八页\总数九十一页\编于十一点免疫亲和色谱过程目标蛋白质抗体制备上样与洗脱介质制备目前五十九页\总数九十一页\编于十一点单抗制备复杂，成本高，但也具有很多优点。目前六十页\总数九十一页\编于十一点色谱介质制备：将抗体通过化学方法结合在色谱介质上抗体之间交联形成不溶性衍生物目前六十一页\总数九十一页\编于十一点单抗问世后，不少生物技术公司在研制适宜于培养杂交瘤细胞的生物反应器及其培养基。这些大规模生产单抗技术的建立和不断完善，

将降低免疫亲和色谱吸附剂的价格。随着新的合成基质和偶联化合物的出现以及对免疫亲和色谱研究的深入，必将使免疫亲和色谱在工业性生产纯化蛋白质的应用上逐渐得到发展。目前六十二页\总数九十一页\编于十一点解吸特异性解吸——半抗原置换非特异性解吸——调节pH值、加入试剂破坏氢键、引入离子对、加入表面活性剂、冷蒸馏水洗涤。目前六十三页\总数九十一页\编于十一点应用根据研究报道,用单克隆抗体亲和色谱从人血小板破碎液中纯化血小板第4因子(PF4)。将单克隆抗体Sz-95-LgG与溴化氰活化的Spharose4B凝胶连接成亲和色谱柱,人血小板破碎液经此亲和色谱柱上样后,经洗脱获得PF4。结果表明,Sz-95-Sepharose4B亲和色谱柱的偶联率为72%,每1mL血小板破碎液中可以纯化到PF418μg。目前六十四页\总数九十一页\编于十一点基团专一性大分子亲和色谱指用对某一类结构相近的物质有亲和性的大分子作为亲和配基偶联在色谱介质上进行的色谱技术。蛋白A亲和色谱伴刀豆球蛋白A亲和色谱肝素亲和色谱目前六十五页\总数九十一页\编于十一点1）分离纯化大分子物质如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的结构与功能：分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。亲和色谱的应用目前六十六页\总数九十一页\编于十一点样品目前六十七页\总数九十一页\编于十一点t-PA的纯化—酶的抑制剂为亲和配基目前六十八页\总数九十一页\编于十一点干扰素的纯化—免疫亲和色谱目前六十九页\总数九十一页\编于十一点脱氢酶的纯化—色素亲和色谱目前七十页\总数九十一页\编于十一点淀粉酶抑制剂的纯化—固定化金属离子亲和色谱目前七十一页\总数九十一页\编于十一点基因重组融合蛋白的纯化目前七十二页\总数九十一页\编于十一点超临界流体色谱法

超临界流体色谱(SupercricalFluidChromatography,SFC)是以超临界流体作为流动相的色谱方法，是20世纪80年代以来发展迅速的一个色谱分支，所谓超临界流体，是指在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态。它既不是气体，也不是液体，但它兼有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性。从理论上说SFC既可以分析GC法难以处理的高沸点、不挥发性样品，又有比HPLC法更高的柱效和更短的分离时间，且可使用二者常用的检测器，也可与MS、FT-IR光谱仪等在线联接，因而可以方便地进行定性、定量分析。在中药药物分析领域已有愈来愈多的应用。目前七十三页\总数九十一页\编于十一点一、超临界流体色谱的特点与原理

Principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography1．超临界流体的特性对于某些纯物质来说，具有三相点和临界点，如图所示，从图中可以看出，物质在三相点，气、液、固三态处于平衡状态，当处于临界温度和临界压力以上时，则不论施加多大压力，气体也不会液化，此时即非气体，也非液体，而是以超临界流体形式存在。目前七十四页\总数九十一页\编于十一点

超临界流体对于分离具有极其有用的物理性质，这些性质恰好介于气体和液体之间。表对气体、液体、和超临界流体的有关物理性质进行了比较。

气体、液体、超临界流体物理性质的比较流动相密度（g/ml）扩散系数（cm2/s）粘度（g/cm.s）气体超临界流体液体约10-30.2-0.90.8-1.01-10-210-3-10-4＜10-510-410-4-10-310-2目前七十五页\总数九十一页\编于十一点2.原理

SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3

SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC；

分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；目前七十六页\总数九十一页\编于十一点压力效应：SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小；压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。

CO2流动相，当压力改变：7.0→9.0×106Pa，则：

C16H34的保留时间25min→5min。目前七十七页\总数九十一页\编于十一点程

序

升

压目前七十八页\总数九十一页\编于十一点HPLC与SFC比较目前七十九页\总数九十一页\编于十一点与GC法和HPLC法比较，因超临界流体的粘度接近于气相色谱的流动相，对溶质的传质阻力小，可以使用更高的流速洗脱，因此SFC的分离速度快于HPLC而与GC相当；超临界流体的扩散率介于GC和LC之间，因而峰展宽小于在气体中。SFC中的流动相不是惰性的传输介质，这不同于GC而与LC一样，溶质与流动相间有相互作用，利用此点可调控选择因子α当考虑溶质分压时，也可利用SFC的两重性，即被测物质在超临界流体中的溶解性非常接近其挥发性，而发生温度却较低，因此，在一定压力下，超临界流体溶解的分子的分压比在气体中高几个数量级，这就可以实现对大分子、热不稳定性化合物、高聚物等的有效分离。目前八十页\总数九十一页\编于十一点二、超临界流体色谱仪的结构与流程1.结构流程

目前八十一页\总数九十一页\编于十一点2.主要部件（1）SFC的高压泵

无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；

（2）SFC的色谱柱和固定相

可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；

SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；目前八十二页\总数九十一页\编于十一点色谱柱①填充柱填充柱与HPLC柱相似，基于分配平衡实现分离，柱长可达25cm，分离柱内径。使用粒径为3-10µm的填料填充。如硅胶、-NH2、-CN及C18、C8等化学键合相均可用于SFC。其中以极性填料的分离效果更好。SFC在手性化合物的分离上效果优于HPLC。在实际操作中，往往会因压力变化而产生较大的柱压降，使柱入、出口处的保留时间有很大差异，所以一般采用高于超临界压力20%左右的压力以减小影响。在填料的选择上也要注意与所分析的样品相适应，如分析极性或碱性化合物时，填料覆盖度小，会产生不对称峰。若使用“封端”填料则会得到改善。目前八十三页\总数九十一页\编于十一点填充柱在重现性、载样量等方面要优于毛细管柱，操作简便，也有用微填充柱的，将3-10μm的填料填充到内径几个毫米或更小的毛细管柱中。②毛细管柱较长用的填充毛细管柱内径≤0.5mm，柱长为10-30mm；开管毛细管柱主要是内径为50-100μm化学交连的各种硅氧烷柱或其它类型的交连柱。SFC色谱柱必须借助柱箱以实现精确的温度控制，范围可以从室温至450°C，同时配低温控制系统，可在-50℃以下工作。目前八十四页\总数九十一页\编于十一点主要部件（3）流动相

SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3

CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；（4）检测器

可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FID检测器目前八十五页\总数九十一页\编于十一点①使用气相色谱检测器，以FID为多用，应用时可将色谱柱的流出物分流，部分流出物通过限流器变为气态进入检测器，若用FID检测时，流动相中不能加入改进剂，否则改进剂本身将给出信号干扰测定，FID对小分子量化合物可得到很好的结果，对分子量大的化合物常得不到单峰，而是一簇峰。如把检测器加热可使分子量大于2000的化合物获得满意的分离。在SFC中也可以使用氮磷检测器（NPD）、火焰光度检测器（FPD）等。目前八十六页\总数九十一页\编于十一点②使用液相色谱检测器。在进入检测器之前应将超临界状态转为液态，可增加检测的灵敏度，使谱带变窄，而且可以在室温下操作，UVD是用改性剂流动相的填充柱SFC的最常用的检测方法。要求检测器必须耐高压。如使用毛细管柱，UVD的流通池可由一段熔融石英毛细管构成，内容积在200nl左右，这样不会影响柱效；荧光检测器（FD）也可以如此应用。对于填充柱，蒸发光散射检测器也是一种常用的通用检测器。目前八十七页\总数九十一页\编于十一点三、超临界流体色谱的流动相和改性剂（一）流动相SFC的流动相为超临界流体。超临界流体的主要特点是在不同压力下对各种样品有不同的溶解能力。其溶解度随超临界流体密度的增加而增加。当两组分的溶解度常数越接近时，，其互溶性就越好。有人研究认为，几种常用的超临界流体的溶解能力在相同的压力条件下顺序是乙烷<二氧化碳<氧化亚氮<三氟甲烷，在相同条件下其分离能力是：二氧化碳＜氧化亚氮＜三氟甲烷≈乙烷。对于SFC流动相的选择应综合考虑。除溶解性能外，还要与检测器相适应，CO2是最常用的流动相。其临界温度低、压力适中，容易操作，相对便宜，无毒无嗅，安全性好，且在190nm以上无紫外吸收。目前八十八页\总数九十一页\编于十一点（二）改性剂在SFC中，弱极性或非极性超临界流体流动相如CO2，对于一些极性化合物的溶解能力较