免疫组织化学技术

免疫组化技术

1第一页，共28页。1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学〔immunohistochemistry〕技术或免疫细胞化学〔技术〕。2、根本原理根据抗原抗体反响和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反响，前者再用标记辣根过氧化物酶〔HRP〕或碱性磷酸酶〔AKP〕等的抗生物素〔如链霉亲和素等〕结合，最后通过呈色反响或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反响产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。

2第二页，共28页。3、目前几种常用免疫组化方法简单介绍1〕免疫荧光方法

利用抗原抗体特异性结合的原理，先将抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。3第三页，共28页。2〕免疫酶标方法是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后参加酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞外表和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。

本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，比照度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等.。4第四页，共28页。4、被检测的物质组织或细胞中但凡能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。5第五页，共28页。5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western

blotting、ELISA的异同1〕Western

blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反响原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然Western

blotting也可定性和定位〔通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位〕，但敏感性远远低于免疫组化技术。2〕ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反响原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。6第六页，共28页。免疫酶标法下的两个实验流程简介一、SP三步法1〕石蜡切片，常规脱蜡至水。2〕0.3%或3%H2O2去离子水〔无色液体〕孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。3〕蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4〕候选步骤：采用抗原修复：微波〔建议30分钟内4次中火〕、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次.5〕血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。6〕滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜〔最好复温〕。PBS冲洗，3分钟×5次。

7〕滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30min-1h。8〕PBS冲洗，3分钟×5次。9〕滴加SP〔链霉亲和素过氧化物酶〕，室温或37℃孵育30min~1h。

10〕PBS冲洗，3分钟×5次。

11〕显色剂显色〔DAB等〕。

12〕自来水充分冲洗。

13〕可进行复染，脱水，透明，14〕选择适当的封片剂封片。

7第七页，共28页。二、二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯PBS冲洗3次，每次3分钟根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性PBS冲洗、浸泡5分钟，3次正常山羊血清室温封闭10分钟8第八页，共28页。甩去血清，参加适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜PBS冲洗，浸泡5分钟，3次滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟PBS冲洗，浸泡5分钟，3次新鲜配置酶底物显色液DAB显色3－10分钟流水冲洗苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜观察拍照IPP软件分析光密度DAB-二氨基联苯胺是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好。是HRP结合物最常用的底物常在免疫组化,原位杂交,Western

blot等膜显色或检测细胞或组织内源性的过氧化物酶中应用广泛。

苏木素是从洋苏木中提取的一种染色剂，它在被氧化后生成苏木精，同媒染剂〔常用的是三价的铁或铝的盐〕一起使用，能够使细胞核染色。苏木素是一种碱性染料。9第九页，共28页。2、免疫荧光方法中的重要环节1〕冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否那么组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2〕组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。3〕血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清〔与二抗来源一致〕封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。4〕一抗孵育条件：在免疫组化反响中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最正确；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。5〕二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，假设是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反响。10第十页，共28页。6〕封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。防止产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，那么可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。7〕切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗〔延长时间和增屡次数〕尤为重要。〔2〕温柔冲洗，防止切片的脱落。3〕冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。〔4〕PBS的pH和离子强度的使用附和要求。11第十一页，共28页。组织与细胞材料的制备组织石蜡切片制作组织冰冻切片制作细胞爬片制作细胞涂片制作12第十二页，共28页。切片的制作组织的固定组织石蜡包埋切片13第十三页，共28页。目的:〔1〕防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。〔2〕使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与自然状态时相仿。防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。〔3〕使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。〔4〕固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。〔5〕防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。〔6〕经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便

于识别。组织材料的固定14第十四页，共28页。固定液的选择：(1)甲醛固定液：10％福尔马林，10％中性福尔马林，10％中性缓冲福尔马林(2)4％多聚甲醛固定液(3)BouinS液及改进BouinS液(4)ZenkerS液(5)ZamboniS液(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，参加2.5%重铬酸25ml。(8)KanovskyS液(9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。(10)PEG液(11)0.4%对苯醌(12)碳二亚酰胺-戊二醛〔ECG-G〕液(13)丙酮及醇类固定剂15第十五页，共28页。固定时间：固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原那么上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。16第十六页，共28页。大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min〔可视观察结果而定〕，石蜡Ⅰ30min石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min〔肉眼观察〕，石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。组织石蜡包埋17第十七页，共28页。切片载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液浸泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。切片粘合剂的使用：

〔1〕多聚赖氨酸〔分子量300KD〕：0.5%浓度。

〔2〕APES试剂〔3-氨基、丙基三氧基硅烷〕干净载玻片→丙酮5min→用镊子夹住浸入APES试剂〔1ml+50ml丙酮〕1～3次→纯丙酮洗二次→枯燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。〔3〕铬矾明胶液：铬矾0.5g明胶5gH2O21000ml〔4〕甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml明胶0.5gH2O2100ml18第十八页，共28页。切片：

石蜡切片：

(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。

(2)52－60℃烤片18h。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)编上号

(6)切片可在4℃保存数年冰冻切片：(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经蔗糖处理24h，冰冻切片。(2)冰冻切片后需凉干后立即固定(3)冰冻切片固定后-80℃保存备用19第十九页，共28页。细胞爬片制作将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。待细胞生长到达60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上。可加甘油封存置于零下20度保存。20第二十页，共28页。细胞涂片制作离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。吸取30－50ul〔可根据细胞量调整〕滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时。在细胞上加一层甘油放-20℃保存。21第二十一页，共28页。荧光标记免疫组织化学

直接法间接法22第二十二页，共28页。本卷须知一、抗体的保存

浓缩抗体：有效期内，只需放在4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。即用型抗体：理论上在4℃冰箱内可保存半年左右。PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放置1-2个月。23第二十三页，共28页。二、出现假阳性的原因组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反