细菌的生理生化反应

细菌的生理生化反应细菌的生理生化反应第1页一、

目标1.1

了解细菌判定中常见生理生化试验反应原理1.2

掌握测定细菌生理生化反应技术和方法

细菌的生理生化反应第2页二、

原理

各种微生物在代谢类型上表现了很大差异。不一样微生物因含有不一样酶系统，分解利用糖类、脂肪类和蛋白类物质能力不一样，其发酵类型和产物也不相同。细菌生理生化反应在菌株分类判定中有很大作用。

细菌的生理生化反应第3页三、

材料

3.1

菌种大肠杆菌（Escherichia

coli）产气肠杆菌（Enterobacter

aerogenes）普通变形杆菌（Proteus

vulgaris）枯草芽孢杆菌（Bacillus

subtilis）斜面菌种

3.2

培养基

糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基、H2S试验培养基、柠檬酸盐培养基

3.3

试剂

V.P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、碘液。

3.4

器具

恒温培养箱、试管、移液管、杜氏小管。细菌的生理生化反应第4页四、步骤(一)

糖类发酵试验（二）

乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)（三）

甲基红试验（M.R.试验）（四）吲哚试验（五）柠檬酸盐试验（六）硫化氢试验（七）淀粉水解试验细菌的生理生化反应第5页(一)

糖类发酵试验原理

可依据细菌分解利用糖能力差异表现出是否产酸产气作为判定菌种依据。是否产酸，(乳酸、醋酸、丙酸等)可在糖发酵培养基中加入指示剂，经培养后依据指示剂颜色改变来判断。是否产气，(甲烷、氢、二氧化碳等)可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。

材料菌种：大肠杆菌、变形杆菌

培养基：配方：蛋白胨水培养基：蛋白胨10gNaCl5g水1000mLpH7.6121℃20分钟。葡萄糖发酵培养液：(蛋白胨水培养基1000mL酸性复红水溶液※2—5mLpH7.6)乳糖发酵培养液试管另配：20℅糖液(葡萄糖、乳糖、蔗糖)

115℃灭菌—30min

制法：1、将上述含指示剂蛋白胨水培养基分装于试管中，每管10mL，内加杜氏管121℃灭菌25min。

2、灭菌后，以无菌操作每管分别加入20℅无菌糖液0.5mL(1℅浓度)即为不一样糖发酵液配养基。

3、※0.5℅酸性复红水溶液100mL+1NNaOH16mL细菌的生理生化反应第6页步骤

1

试管标识

取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养液试管各2支，(如设空白取3支)每

种糖发酵试管中均分别标识大肠杆菌、普通变形杆菌。2

接种培养以无菌操作分别接种少许菌苔至以上各对应试管中。置37℃恒温箱中培养，培养24h-48h，观察结果。细菌的生理生化反应第7页

与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，统计用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，统计用“＋”表示。培养液中杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，统计用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，统计用“－”表示。

结果观察细菌的生理生化反应第8页（二）

乙酰甲基甲醇试验〔〈伏-普〉(Voges-Proskauer二氏)〕V．P试验〕

原理

一些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇(CH3.CO.CHOH.CH3)，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中胍基生成红色化合物，称V.P（+）反应。

材料

菌种:大肠杆菌（Escherichia

coli）、产气肠杆菌（Enterobacter

aerogenes）

培养基：葡萄糖蛋白胨水培养液配方：葡萄糖5g蛋白胨5gK2HPO42gH2O1000mlPH7.0—7.2115℃灭菌30min

步骤

1

标识试管

:取2支装有葡萄糖蛋白胨培养液试管，分别标识大肠杆菌、产气肠杆菌。

2

接种培养

:以无菌操作分别接种少许菌苔至以上对应试管中。置37℃恒温箱中，培养24～48h。细菌的生理生化反应第9页

取出以上试管，振荡2min。加入等量V.P试剂；振荡试管，以使空气中氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min。

若培养液呈红色，统计为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，统计为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。结果观察细菌的生理生化反应第10页（三）

甲基红试验（M.R.试验）原理

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，深入分解中，因为糖代谢路径不一样，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至pH4.2以下，培养液由原来桔黄色，使甲基红指示剂变红。

材料

菌种同V.P试验培养基同V.P试验步骤

同V.P试验1

标识试管:取2支装有葡萄糖蛋白胨培养液试管，分别标识大肠杆菌、产气肠杆菌。

2

接种培养

:以无菌操作分别接种少许菌苔至以上对应试管中。置37℃恒温箱中，培养24～48h。细菌的生理生化反应第11页取出以上试管，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层。若培养液上层变成红色，即为阳性反应，用“＋”表示；若仍呈黄色，则为阴性反应，用“－”表示。结果观察细菌的生理生化反应第12页（四）吲哚试验原理

:有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中色氨酸生成吲哚。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛试剂）时，该试剂与吲哚作用，形成红色玫瑰吲哚(红色化合物)。

材料菌种：同V．P试验

培养基：蛋白胨水培养基

试剂：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。

步骤

1

试管标识

:取装有蛋白胨水培养液试管2支，分别标识大肠杆菌、产气肠杆菌。

2

接种培养

:以无菌操作分别接种少许菌苔到以上对应试管中，置37℃恒温箱中培养24～48h。细菌的生理生化反应第13页

取出以上试管，在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液上面，此时沿管壁迟缓加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察）。如有吲哚存在，乙醚层展现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，不然为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。

结果观察细菌的生理生化反应第14页（五）柠檬酸盐(利用)试验原理

有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐后，产生碱性化合物，使培养基pH升高，当培养基中加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，就会由绿色变为深蓝色。（溴麝香草酚蓝指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.0~7.6时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。）材料菌种：同V．P试验

培养基：柠檬酸盐培养基（固体斜面）配方：NH4H2PO41gK2HPO41gNaCI5gMgSO40.2g柠檬酸钠2g琼脂16g水1000mL1℅溴麝香草酚蓝(酒精液)10mLPH6.8。加热溶解后调PH，然后加入指示剂121℃灭菌25min步骤

1

试管标识

取装有柠檬酸盐培养基固体斜面试管2支，分别标识大肠杆菌、产气肠杆菌。

2

接种培养

以无菌操作分别接种少许菌苔到以上对应试管斜面上做“之”字形划线，置37℃恒温箱中培养24～48h。细菌的生理生化反应第15页结果观察

培养基颜色由绿色变为深蓝为阳性，不变者为阴性。细菌的生理生化反应第16页（六）硫化氢试验原理

有些细菌能分解含硫有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中铅盐或铁盐等，就形成黑色硫化铅或硫化铁沉淀物。材料菌种：大肠杆菌、变形杆菌培养基：H2S试验培养基（固体）步骤

1

试管标识:取装有H2S试验固体培养基试管2支，分别标识大肠杆菌、变形杆菌。

2

接种培养:以无菌操作分别用接种针挑取少许菌苔到以上对应试管做穿刺接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。细菌的生理生化反应第17页结果观察细菌的生理生化反应第18页（七）淀粉水解试验原理

有些细菌可产生淀粉酶水解培养中淀粉为糊精，或深入水解为麦芽糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝。材料菌种：大肠杆菌、枯草杆菌培养基：淀粉培养基（固体）(pH值:7.2)

配方:每升培养基含

蛋白胨:10g

牛肉膏:5gNaCl:5g

可溶性淀粉:2g

琼脂:20g细菌的生理生化反应第19页（七）淀粉水解试验步骤

1

培养皿标识

取装有淀粉培养基（固体）培养皿一只，在培养皿两侧分别标识大肠杆菌、枯草杆菌。

2

接种培养

以无菌操作分别用接种环挑取少许菌苔到培养皿对应部位做十字接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。细菌的生理生化反应第20页结果观察取出平板，加上少许碘液，轻轻摇动，使碘液铺满平板表面，观察菌落周围是否出现透明圈及圈大小。细菌的生理生化反应第21页六试验结果与分析细菌的生理生化反应第22页1配制培养基糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基淀粉培养基色H2S试验培养基柠檬酸盐培养

每组配制一个培养基,300mL.试验