细菌生理检查法

细菌生理检查法细菌生理检查法第1页第一节

细菌培养

一、培养基及种类

二、细菌培养条件

三、细菌接种与培养

第二节

常见培养基制备

一、生化试验培养基和试剂

二、普通培养基和专用培养基细菌生理检查法第2页一、培养基及种类依据培养基用途来区分：

(1)通用培养基：培养异氧细菌最常见培养基是牛肉膏蛋白胨培养基；配制适合于厌氧菌生长培养基时，通常须在培养基中加入适量还原剂如巯基醋酸钠、维生素C或半胱氨酸来降低培养基氧化还原电位，以利于厌氧菌生长。

(2)判别培养基：是一类在成份中加有能与目标菌无色代谢产物发生显色反应指示剂，从而到达只需用肉眼区分颜色就能方便地从近似菌落中找出目标菌落培养基。(伊红－美蓝琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、亚硫酸铋琼脂、微生物快速显色培养基）

(3)选择性培养基：依据某微生物特殊营养要求或对某化学、物理原因抗性而设计培养基，含有使混合菌样中劣势菌变成优势菌。（马丁氏培养基、Ashby无氮培养基）有些培养基是含有选择和判别双重作用。比如食品检验中常见麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐含有抑制肠道菌以外细菌作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区分乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。细菌生理检查法第3页依据对培养基组成物质化学成份是否完全了解来区分：１）天然培养基天然培养基是指利用各种动、植物或微生物原料，其成份难以确切知道。用作这种培养基主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成培养基即使不能确切知道它化学成份，但普通来讲，营养是比较丰富，微生物生长旺盛，而且起源广泛，配制方便，所以较为常见，尤其适合于配制试验室常见培养基。这种培养基稳定性常受生产厂或批号等原因影响。２）合成培养基合成培养基是一类化学成份和数量完全知道培养基，它是用已知化学成份化学药品配制而成。这类培养基化学成份准确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长迟缓，所以它只适合用于做一些科学研究，比如营养、代谢研究。３）半合成培养基在合成培养基中，加入某种或几个天然成份；或者在天然培养基中，加入一个或几个已知成份化学药品即成半合成培养基。比如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和试验室中使用最多。细菌生理检查法第4页依据培养基物理状态来区分：１）液体培养基所配制培养基是液态，其中成份基础上溶于水，没有显著固形物，液体培养基营养成份分布均匀，易于控制微生物生长代谢状态。２）固体培养基在液体培养基中加入适量凝固剂即成固体培养基。常见作凝固剂物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常见。固体培养基在实际中用得十分广泛。３）半固体培养基假如把少许凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它用量在0.2~1%之间。这种培养基有时可用来观察微生物动力，有时用来保藏菌种。细菌生理检查法第5页培养基制备技术

－－培养基制备基础方法和注意事项

培养基所用化学药品均应是化学纯。使用蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长;因培养基在加热消毒过程中、pH会有所改变，培养基各成份完全溶解后，应进行PH初步调正。比如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著升高。培养基分装，应按使用目标和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内:液体分装至试管1/4左右为宜；如固体则分装量为管高1/5；半固体培养基，则分装至试管1/2~1/3为宜；锥形瓶分装培养基时，容量应不超出容积二分之一为宜；Φ＝9cm培养皿可倒入15ml培养基。普通培养基可采取121°C高压蒸汽灭菌15分钟方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊要求，即可用此法灭菌。一些畏热成份，如糖类，应另行配成20%或更高浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50°C左右培养基中。细菌生理检查法第6页灭菌和消毒消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部病原菌营养体方法，灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部全部微生物，使之呈无菌状态。

细菌生理检查法第7页灭菌和消毒

－－物理方法

温度：利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常见而又方便有效方法。高温可使微生物细胞内蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。a.灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌快速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用污染物品或试验动物尸体等灭菌。b.干热空气灭菌法：这是试验室中常见一个方法，即把待灭菌物品均匀地放入烘箱中，升温至160°C，恒温1小时即可。此法适合用于玻璃皿、金属用具等灭菌。附：电热恒温干燥箱（俗称“烤箱”）使用把待灭菌物品均匀地放入烤箱中，关上箱门，调整温度至160°C，打开电源，待温度上升至160°C时计时，维持该温度0.5-1小时。注意：多观察几次温度，预防温度失控。用量较少试验室能够做几个铁皮筒，盖子侧面带孔，灭菌时将孔打开，灭菌冷却过后将孔关闭。能够将吸管每支单独用白纸包裹用脱水粘上（预防纸散开来），装入铁皮筒灭菌，使用时能够单独拿，防止污染其它吸管。玻璃皿也能够单独用白纸包裹用脱水粘上，装入铁皮筒灭菌。无菌瓶能够盖上盖子，用用白纸包起盖子，用棉线扎起来，不能够用尼龙线，因为尼龙线不耐高温，易断。细菌生理检查法第8页灭菌和消毒

－－物理方法湿热灭菌法:在一样温度下，湿热灭菌效果比干热灭菌好，这是因为首先细胞内蛋白质含水量高，轻易变性。另首先高温水蒸汽对蛋白质有高度穿透力，从而加速蛋白质变性而快速死亡。a.巴氏消毒法：有些食物会因高温破坏营养成份或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低温度来杀死其中病原微生物，这么既保持食物营养和风味，又进行了消毒，确保了食品卫生。该法普通在62°C，30分钟既可到达消毒目标。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。b.煮沸消毒法：直接将要消毒物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌全部营养和个别芽孢。若在清水中加入1%碳酸钠或2%石炭酸，则效果更加好。此法适合用于注射器、毛巾及解剖用具消毒。c.间歇灭菌法：上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而极难做到完全无菌。若采取间歇灭菌方法，就能杀灭物品中全部微生物。详细做法是：将待灭菌物品加热至100°C，15~30分钟，杀死其中营养体。然后冷却，放入37°C恒温箱中过夜，让残留芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可到达灭菌目标。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。细菌生理检查法第9页灭菌和消毒

－－物理方法d.加压蒸汽灭菌法：把待灭菌物品放在一个可密闭加压蒸汽灭菌锅中进行，以大量蒸汽使其中压力升高。因为蒸汽压上升，水沸点也随之提升。在蒸汽压到达1.055千克/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内温度可到达121°C。在这种情况下，微生物（包含芽孢）在15~20分钟便会被杀死，而到达灭菌目标。如灭菌对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差物品，则应适当延长灭菌时间。在加压蒸汽灭菌中，要引发注意一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中冷空气，不然表上蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这么会大大降低灭菌效果。附：高压锅使用打开锅盖，取出内锅，观察水量，补充水量至比墩子略高，将需灭菌物品放入内锅，盖上盖子，对称旋紧螺栓，关闭放气阀，打开电源，待压力表上指针指向0.05时打开放气阀放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，待压力表上指针指向0.05时再次打开放气阀放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀；冷气放完后，待压力表上指针指向0.10时打开放气阀，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，重复放气2-3次，最终拨下电源，不打开放气阀，让其自然冷却。取物品时一定要将放气阀打开，等到压力表上指针指向0时方可对称旋松螺栓，打开盖子取出物品。细菌生理检查法第10页灭菌和消毒

－－物理方法影响灭菌原因

a.不一样微生物或同种微生物不一样菌龄对高温敏感性不一样。多数微生物营养体和病毒在50~65°C，10分钟就会被杀死；但各种孢子、尤其是芽孢最能抗热，其中抗热性最强是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121°C，12分钟才被杀死。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感;b.微生物数量多少显然会影响灭菌效果，数量越多，热死时间越长;c.培养基成份与组成也会影响灭菌效果。普通地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提升抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不一样盐类可能对灭菌产生不一样影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。灭菌对培养基成份影响

a.pH值普遍下降;b.产生混浊或沉淀，这主要是因为一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。比如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀;c.不少培养基颜色加深;d.体积和浓度有所改变;e.营养成份有时受到破坏。细菌生理检查法第11页灭菌和消毒

－－物理方法辐射：利用辐射进行灭菌消毒，能够防止高温灭菌或化学药剂消毒缺点，所以应用越来越广，当前主要应用在以下几个方面：１）接种室、手术室、食品、药品包装室常应用紫外线杀菌。２）应用β射线作食品表面杀菌，γ射线用于食品内部杀菌。经辐射后食品，因大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保留期延长。过滤：采取机械方法，设计一个滤孔比细菌还小筛子，做成各种过滤器。经过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而到达除菌目标。这种灭菌方法适合用于一些对热不稳定体积小液体培养基灭菌以及气体灭菌。它最大优点是不破坏培养基中各种物质化学成份。不过比细菌还小病毒依然能留在液体培养基内，有时会给试验带来一定麻烦。细菌生理检查法第12页灭菌和消毒

－－化学方法普通化学药剂无法杀死全部微生物，而只能杀死其中病原微生物，所以是起消毒剂作用，而不是灭菌剂。能快速杀灭病原微生物药品，称为消毒剂。能抑制或阻止微生物生长繁殖药品，称为防腐剂。不过一个化学药品是杀菌还是抑菌，常不易严格区分。消毒剂在低浓度时也能杀菌（如1：1000硫柳汞）。因为消毒防腐剂没有选择性，所以对一切活细胞都有毒性，不但能杀死或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用于体表、器械、排泄物和周围环境消毒。常见化学消毒剂有：石碳酸、来苏水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。细菌生理检查法第13页微生物分离、纯化与接种技术接种工具和方法在试验室或工厂实践中，用得最多接种工具是接种环、接种针。因为接种要求或方法不一样，接种针针尖部常做成不一样形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。

接种和分离工具

1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀

细菌生理检查法第14页微生物分离、纯化与接种技术划线接种：这是最常见接种方法。即在固体培养基表面作往返直线形移动，就可到达接种作用。常见接种工含有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常见此法。细菌生理检查法第15页划线接种，分离纯化Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies细菌生理检查法第16页灼烧细菌生理检查法第17页细菌生理检查法第18页微生物分离、纯化与接种技术斜面接种技术细菌生理检查法第19页微生物分离、纯化与接种技术

－－细菌涂布分离技术细菌生理检查法第20页微生物分离、纯化与接种技术

－－液体接种法、穿刺接种液体接种法：包含从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都能够用接种环接种。但在培养量比较大情况下，液体接种宜采取移液管接种，同时要求无菌操作。细菌生理检查法第21页微生物培养

－－微生物培养中氧气条件培养设备：包含接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵——摇床、厌氧培养罐等。好氧培养：比如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养方法。厌氧培养：除了最简便深层液体培养以外，能够采取物理、化学或生物学方法来排除培养容器中空气或空气中氧气，创造厌氧条件。对于严格厌氧微生物，要用化学和物理并用方法。在进行厌氧培养时，能够用指示剂检验系统中还原条件，普通试验室中常见如葡萄糖——美兰指示剂。细菌生理检查法第22页微生物培养

－－微生物培养中厌氧条件生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常见方法是在密封干燥器底部放入发芽种子，因种子呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中氧气。在容器一边放一包用吸水紙包好焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，二者反应时吸收容器中氧气，创造厌氧条件。物理方法：常见真空泵抽出密封干燥器内空气或再充入其它惰性气体，以确保厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。普通为到达严格厌氧目标，常采取物理和化学相结合并用方法。细菌生理检查法第23页微生物培养

－－微生物培养中厌氧培养美兰氧化还原指示剂：0.006NNaOH0.015%美兰溶液6％葡萄糖溶液上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，快速放入厌氧罐中。细菌生理检查法第24页微生物分离、纯化与接种技术

－－液体接种法、穿刺接种液体接种法：包含从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都能够用接种环接种。但在培养量比较大情况下，液体接种宜采取移液管接种，同时要求无菌操作。细菌生理检查法第25页微生物培养

－－微生物培养中氧气条件培养设备：包含接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵——摇床、厌氧培养罐等。好氧培养：比如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养方法。厌氧培养：除了最简便深层液体培养以外，能够采取物理、化学或生物学方法来排除培养容器中空气或空气中氧气，创造厌氧条件。对于严格厌氧微生物，要用化学和物理并用方法。在进行厌氧培养时，能够用指示剂检验系统中还原条件，普通试验室中常见如葡萄糖——美兰指示剂。细菌生理检查法第26页微生物培养

－－微生物培养中厌氧条件生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常见方法是在密封干燥器底部放入发芽种子，因种子呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中氧气。在容器一边放一包用吸水紙包好焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，二者反应时吸收容器中氧气，创造厌氧条件。物理方法：常见真空泵抽出密封干燥器内空气或再充入其它惰性气体，以确保厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。普通为到达严格厌氧目标，常采取物理和化学相结合并用方法。细菌生理检查法第27页微生物培养

－－微生物培养中厌氧培养美兰氧化还原指示剂：0.006NNaOH0.015%美兰溶液6％葡萄糖溶液上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，快速放入厌氧罐中。细菌生理检查法第28页

微生物细胞大小和数量测定目标要求：学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下测定微生物大小方法；学习使用血球记数板测定微生物数量方法。试验材料：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、细菌染色片、血球记数板、酵母菌悬液、盖玻片、无菌滴管、西水纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯细菌生理检查法第29页测定微生物大小测定工具：目镜测微尺镜台测微尺细菌生理检查法第30页测定微生物大小

目镜测微尺校正：在高倍镜下，看清镜台测微尺刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺刻度平行，移动推进器，使目镜测微尺0点与镜台测微尺某一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合刻度。计算两刻度间目镜测微尺格数和镜台测微尺格数。因为镜台测微尺刻度每格长10µm，所以可得：目镜测微尺每格长度（µm）=（镜台测微尺格数×10）/目镜测微尺格数

注意：校正目镜测微尺必须针对特定显微镜和附件（特定接物镜、接目镜、镜筒长度等）进行，而且只能在这特定情况下才可重复使用。菌体大小测定：取下镜台测微尺，将细菌染色标本置于载物台上，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体长和宽。细菌生理检查法第31页测定微生物数量方法：活菌计数法——平板菌落计数法；总菌计数法——血球计数板或霍瑟（PeroffHausser）细菌计数板（二者原理和部件相同，只是厚薄不一样而已）。

细菌生理检查法第32页测定微生物数量本试验用血球计数板计数酵母菌数量取清洁无油血球计数板，在计数室上面加盖玻片。取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗透，计数室内不得有气泡。静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。高倍镜下计数：随机计数五个中格平均值，然后求得每个中格平均值。乘上16（或25）就得出一大格中总菌数，最终再换算到每mL菌液中含菌数。计算方法：注意事项：压在方格线上菌体，以压在底线和右侧线上菌体计入本格内；碰到有芽体酵母时，若芽体和母体同等大，就按单个酵母计数。计数完成后，血球计数板要马上清洗洁净，并用吸水纸吸干，最终用擦镜纸擦洁净，并放回盒内。（X1+X2+X3+X4+X5）5×25（或16）×10×

1000×

稀释倍数酵母菌细胞数/mL=细菌生理检查法第33页细菌生理学检验法

－－微生物保藏方法斜面冰箱保藏法：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后，普通形成芽孢细菌要形成芽孢，形成孢子微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞部位用尼龙紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。普通每隔3个月至六个月用新鲜培养基移植1次。方法简便，试验室均采取。

缺点：移接代数太多，易产生变异、退化。石蜡封藏法：在已长好斜面菌种上加入无菌液体石蜡油，高出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，适用保留细菌和放线菌。石蜡处理：250mL三角瓶装100mL液体石蜡，1.05kg/cm3高压灭菌30min，然后放在1050C左右烘箱中1h，使水分蒸发掉。砂土管保藏法：(可用于保藏产孢子放线菌、霉菌和产芽孢细菌）。1.砂土管制备：取河沙若干，用40目过筛，出去大颗粒，加10％HCl后煮沸30min，除去有机质（也可用10％HCl浸泡2—4h)。最终倒去酸水，用自来水冲洗至中性，烘干备用。另取0.3m以下非耕作层瘦黄土若干，晒干磨细，过120目筛。

2.按土：砂＝1：4

百分比均匀混合，装入指形管中，以1cm高为宜，塞上棉塞，160～1700C干热灭菌2h。

3.在新鲜菌种斜面上加入3mL左右无菌水，用无菌接种环制成菌悬液，用无菌吸管吸收0.2～0.3mL菌悬液放入每个砂土管中，用接种环拌匀，并贴上标签，注明菌名。

4.菌液加好后，马上进行抽真空干燥，要求在24h内抽干，尤其是夏天要求较短时间内抽干。摇散砂土，放干燥器内冰箱保藏。冷冻真空干燥保藏法：此法普通常见于细菌或病毒一类菌种保藏，常见脱脂牛奶或血清作为菌种保护剂。细菌生理检查法第34页细菌生理学检验法

－－微生物生化反应生化反应来测定微生物代谢产物，生化反应常见来判别一些在形态和其它方面不易区分微生物。糖酵解试验淀粉水解试验V-P试验甲基红（MethylRed）试验靛基质（Imdole）试验枸椽酸盐试验：尿素酶（Urease）试验三糖铁（TSI）琼脂试验细菌生理检查法第35页细菌生理学检验法

－－糖酵解试验

不一样微生物分解利用糖类能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。