基因工程基础课件

第10章基因工程基础

第一节基因工程概述第二节目的基因的获得第三节分子克隆中常用的载体第四节分子克隆中常用的工具酶第五节目的基因和载体连接、转化、筛选第六节基因工程和医药烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversityDNA克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合.获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning),即无性繁殖.技术水平:DNA克隆:分子克隆(molecularclone)细胞克隆个体克隆(动物或植物)第一节基因工程概述烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversityDNA克隆:应用酶学的方法,在体外将各种来源的DNA(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的分子——复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA).烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity分切转筛表接烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity第二节目的基因的获得一目的基因的获得:化学合成聚合酶链式反应(PCR)方法扩增建立基因组DNA文库构建cDNA文库烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity化学合成法:

要求:1)已知目的基因的序列或其产物的氨基酸序列

2)片段不宜太长工具:自动化DNA合成仪应用:1)合成PCR引物

2)寡核苷酸探针

3)人工接头序列及较小的基因烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity聚合酶链式反应(PCR)方法扩增1985年美国科学家Mullis发明了聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术PCR是应用最广的分子生物学技术之一,可用来快速在体外扩增DNA,PCR技术在临床检验和分子生物学中的应用十分广泛.PCR技术就是在体外的离心管中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因的技术,即体外进行DNA复制.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity需要的物质:模板DNA,引物,dNTP(Mg2+),TaqDNA聚合酶4种反应混合物经历变性、退火、延伸三步

94℃,热变性,双链解开

55℃,冷却退火,引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合

72℃,TaqDNA聚合酶作用下,新链延伸,形成互补DNA双链如此30个循环可获得230个基因片段烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity聚合酶链反应原理烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity建立基因组DNA文库基因组DNA文库:分离供体细胞中的染色体DNA,酶切后,将这些染色体DNA片段与某种载体相接,而后转入大肠杆菌,建立包含有供体染色体DNA片段的克隆株,特点:克隆株群体提供全套遗传信息,即完整的基因组DNA烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity构建基因组文库过程:⑴分离纯化基因组DNA⑵制备全部基因组的DNA片段

①机械断裂法(超声波或高速搅拌)断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入载体之前还需要进行修饰加工,少用②限制性内切酶降解(鸟枪法)(常用Sau3A)断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端,可以直接与处理过的载体连接⑶DNA片断与载体的连接常用载体:λ噬菌体⑷转化细菌

1个克隆含有基因组的某个片段,整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity构建cDNA文库cDNA文库:以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA(cDNA)建立基因文库.特点:无内含子,长度比基因组基因小,操作简单mRNA比基因组中基因少,筛选基因工作量小mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利于获得较多的模板.可在原核细胞中表达有生物活性蛋白不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同不能研究基因组的结构功能烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity2)第一股cDNA合成

以Oligo(dT)为引物:从模板3’末端开始,沿模板3’→5’方向合成随机引物:以6～8个核苷酸为随机引物,从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链

3)第二股cDNA的合成

自身引导法外加引物合成法

烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity4)cDNA与载体连接和导入宿主细胞烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity根据使用目的分为：克隆载体：使插入的外源DNA序列扩增表达载体：使插入的外源DNA序列转录翻译成多肽链理想的质粒载体,应具备以下几个条件(1)能自主复制,即本身是复制子(2)具有一种或多种限制酶的单一切割位点,并在此位点中插入外源基因片段,不影响本身的复制功能(3)在基因组中有1-2个筛选标记,为寄主细胞提供易于检测的表型特征,(4)分子量要小,多拷贝,易于操作.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity一质粒载体1.质粒的基本特性本质是细菌染色体以外的遗传物质,是一种简单的,能自主复制的环状DNA分子.命名:前一个小写p代表质粒,后两个大写英文字母代表发现者或实验室,数字代表编号,如pBR322烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity1、接大肠杆菌于4mlLB培养基

2、37℃振荡培养过夜

3、取1.5ml菌液于Ep管,5000rpm离心3min,弃上清

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖,50mM/LEDTApH8.0,25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合

5、加入0.2ml溶液II(0.2mM/LNaOH,1％SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5min

6、加入0.15m1预冷溶液III(5mol/LKAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5min

7、10000rpm离心15min,取上清液于另一新Ep管

8、加入等体积的异戊醇,混匀后于静置10min

9、再以10000rpm离心5min,弃上清

10、用70％乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体

11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity3.大肠杆菌质粒载体1)pSC101质粒载体第一个克隆真核基因的载体(非洲爪蟾卵母细胞rDNA)烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

AmprORITetr2)pBR322质粒:一种克隆质粒ORI:复制起始点,保证高拷贝自我复制.结构:Ampr,

Tetr:两个抗性基因用于筛选阳性克隆.PstI,BamHI:两个单酶切位点用于插入目的基因烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity3)多功能质粒-pUC质粒pUC质粒由pBR322改建成的,带有LacZ基因.LacZ上有多克隆位点,插入外源基因后在X-gal平板上使原先的蓝斑变成白斑.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity4)pET系统(Novagen公司)烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity5.酵母表达常用载体烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity6.哺乳动物细胞常用表达载体烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity腺病毒载体系统

烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversityBACK烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity常用的工具酶（toolenzymes）有：1.限制性核酸内切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)2.DNA连接酶（DNAligase)3.逆转录酶(reversetranscriptase)6.末端转移酶(terminaltransferase)以1.和2.最为常用.工具酶现已商品化第四节分子克隆中常用的工具酶烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity一限制性核酸内切酶定义:一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶.限制性内切酶的发现Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断,从而保证其不被外来噬菌体所感染,而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰(甲基化)而得以保护,这种现象叫做限制－修饰.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序.命名HindⅢ属

种

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到第一个限制性内切核酸酶HindI烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity分类:Ⅰ型:识别和切割位点不固定,随机Ⅲ型:核酸内切酶活性和甲基化活性不分开Ⅱ型:能特异在识别位点处切割DNA.核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的.最常用！烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversityⅡ型限制性核酸内切酶基本特性:特异的识别4~8个核苷酸组成的识别序列,识别序列呈回文结构:两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’EcoRⅠ烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

1.产生5′突出粘性末端(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA

5′3′3′5′—OH—P

AATTC*********G*********5′3′3′5′P

OH—经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型:烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

2.产生3′突出粘性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

3.产生平末端(bluntend)AluI*************AGCT**************************TCGA*************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*************AG*************TC5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity影响限制性内切酶活性的因素DNA的纯度,增加酶量、扩大体积、延长时间DNA的甲基化,选用失去甲基化功能的菌株温度,一般37,还有25.30.60等分子结构,超螺旋,线性,识别序列两侧限制酶的缓冲液,Mg2+,Tris-Cl,DTT,BSA,NaCl,KCl等

星号活性(staractivity)EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity限制性内切酶用途:

基因重组过程中切割DNA以获取目的基因片段,切割载体形成切口,使目的基因能插入载体中.2.限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphysms,

RFLP)分析:遗传病的诊断,法医

DNA指纹分析等.3.构建DNA的物理图谱,基因定位,DNA的同源性分析等等.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity二DNA连接酶DNA连接酶(Ligase)是一种能够催化在双链DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键的酶,可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复,不能连接单链DNA或裂口常用的是T4DNA连接酶：来源－噬菌体T4感染Ecoli烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity三逆转录酶以RNA为模板,逆转录成cDNA第一链,又称依赖RNA的DNA聚合酶.(AMV最常用)聚合酶活性:RNA或DNA为模板3’外切酶活性:能降解DNA-RNA杂合链中的RNA应用:1.RT-PCR使mRNA逆转录成cDNA2.制备探针商品化逆转录酶有两种：

①AMV(禽成髓细胞瘤)②Mc-MLV(鼠白血病病毒).烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity四末端脱氧核苷酸转移酶(terminaltransferase,TTE)可催化DNA片段上3’-OH端加接脱氧核糖核苷酸(不需模板,但底物至少要3个bp,需Mg2+)常用于同种碱基多聚体接尾反应核素标记DNA片段的3’端

烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity第五节目的基因和载体连接、转化、筛选一外源基因与载体的连接粘性末端连接方式:(1)同一限制酶切位点连接

(2)不同限制酶切位点连接烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversityBamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity不同限制酶切位点的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity2.平端连接限制性内切酶切割产生的平端，直接连接效率低烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity导入大肠杆菌1.原生质体转化法2.氯化钙转化法3.电击法导入哺乳动物细胞1.显微注射法2.电穿孔法3.DNA-磷酸钙共沉淀4.DEAE-葡聚糖转染法5.病毒感染法6.脂质体介导法7.细胞融合法8.原生质体融合法二重组DNA导入受体菌烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

转化就是以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞(感受态)的过程.

感受态细胞是指细胞处于容易接受外源DNA的状态.常用CaCl2法制备,过程:

接种细菌振荡过夜——以约1:100的接种量接入新的20mlLB中—培养至OD600≈0.3-0.4,离心(5K,5’)收集菌体—加入预冷CaCl2(10ml100mM)冰浴20’—离心收集菌体—加入100ul100mM预冷CaCl2混匀—加甘油保存-80度烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity转化方法:㈠原生质体转化法除去细胞壁后加外源DNA,经吸收恢复再生培养,如枯草杆菌㈡化学转化法(CaCl2法)冰浴30min—42℃90s—冰浴2min—加37℃预热LB培养45min,取50-200ul/皿涂布,37℃倒置培养过夜,观察细菌生长情况㈢电穿孔法原理:利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入,脉冲过后,微孔复原.操作更简单,转化效率高,不仅无需制备感受态细胞,而且适用于任何菌株.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity三.转化子的筛选与鉴定转化子,重组子,阳性克隆:都指带有重组质粒(含目的基因)的菌株烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity利用遗传标志的表型特征筛选烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity2.β-半乳糖苷酶(LacZ)基因失活筛选法非重组质粒:不含有插入的DNA蓝色菌落重组质粒:含有插入的DNA:白色菌落非重组质粒重组质粒烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity(二)根据重组子的结构特征筛选1)重组子大小鉴别筛选菌落——提取质粒——电泳2)酶切鉴定菌落——提取质粒——双酶切——电泳3)PCR筛选法能与插入基因片断两端互补的特异引物,以少量抽提的重组子DNA为模板,进行PCR分析

4)测序烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity原位杂交烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity一疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质,而认识疾病的分子机制.第六节基因工程和医药烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity二生物制药基因工程可大量生产天然稀有存在的重要的肽或蛋白质.基因工程可根据人的意愿设计生产出天然不存在的有重要生物活性的肽或蛋白质.人类基因组计划及后基因组计划的成果将为基因工程提供难于估量的广阔发展空间.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity三基因诊断基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理,在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变.

发现并获得某种疾病的特异性基因是基因诊断的基础.烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity四基因治疗(genetherapy)

基因治疗的策略1.基因置换:以正常基因替换缺陷基因.一切通过基因水平的操作而达到,治疗疾病目的疗法.2.基因补偿:导入正常基因,补偿缺陷基因的功能.3.基因失活:用反义核酸封闭有害基因的表达.

定义:烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity

1.目的基因的表达水平太低或难于精确控制.2.目的基因的转移和表达缺乏足够的靶向性.3.对基因表达调控、基因表达产物的功能的认识还很少.目前基因治疗面临的问题烟台大学药学院SchoolPharmacyofYantaiUniversitySchoolPharmacyofYantaiUniversity补充：多利诞生的过程1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞,分离基因备用.2.取出第二只母羊未受精的卵细胞,取出基因换上第一只羊乳腺细胞基因(“掉包”),放电激活该卵细胞,使之象正常受精卵一样进行细胞分裂,直至一定阶段,胚胎成熟.3.将成熟的胚胎移植到第