微生物指标和微生物检验

我国旧饮用水水质标准是1985年颁布实施GB5749-85，标准检验方法为GB5750-85。该标准与国外饮用水标准相比，主要差异在于微生物指标项目少，缺乏有机物和消毒副产物指标。微生物指标只有细菌总数和总大肠菌群2项，不能确切评价水质卫生情况。修订后标准，微生物学指标增加为6项：菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫和隐孢子虫。同时在资料性附件中增加了肠球菌和产气荚膜梭状芽胞杆菌。微生物指标和微生物检验第1页水质常规指标及限值修订前修订后微生物指标限值微生物指标限值细菌总数100CFU/mL菌落总数/（CFU/mL）100总大肠菌群每100mL水样中不得检出总大肠菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出粪大肠菌群每100mL水样中不得检出耐热大肠菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出游离余氯在与水接触30min后应不低于0.3mg/L,管梢末水不应低于0.5mg/L大肠埃希氏菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出微生物指标和微生物检验第2页水质非常规指标及限值修订前修订后微生物指标限值微生物指标限值-菌落总数/（CFU/100mL）500小型集中式供水和分散式供水部分水质指标及限值修订前修订后微生物指标限值微生物指标限值-贾第鞭毛虫/（个/10L）<1-隐孢子虫/（个/10L）<1微生物指标和微生物检验第3页生活饮用水水质参考指标及限值修订前修订后微生物指标限值微生物指标限值-肠球菌/（CFU/100mL）0-产气荚膜梭状芽胞杆/（CFU/100mL）0微生物指标和微生物检验第4页一、菌落总数修订前修订后细菌总数原理：细菌总数是指水样在一定条件下培养后（培养基成份、培养温度和时间、pH、需氧性质等）所得1ml水样所含菌落总数。按本规范要求所得结果只包含一群能在营养琼脂上发育嗜中温需氧细菌菌落总数培养条件：36±1℃24h菌落总数定义：水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1ml水样所含菌落总数。36±1℃48h微生物指标和微生物检验第5页二、总大肠菌群（埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属）除多管发酵法、滤膜法外，增加了酶底物检测方法多管发酵法修订前修订后多管发酵法原理：总大肠菌群系指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌群主要起源于人畜粪便，含有指示菌普通特征，故以此作为粪便污染指标评价饮水卫生质量。总大肠菌群定义：总大肠菌群指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。结果：5个10ml管中阳性管数为0时，MPN值为0（主要针对出厂自来水或需天天检验一次水样）结果：5个10ml管中阳性管数为0时，MPN值<2.2

微生物指标和微生物检验第6页滤膜法修订前修订后滤膜法原理：用孔径为0.45μm微孔滤膜过滤水样,细菌被截留在滤膜上,将滤膜贴在选择培养上,经培养后,计数生长在滤膜上经典大肠菌群菌落数。培养条件：37℃18-24h滤膜法定义：总大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45μm微孔滤膜过滤水样,将滤膜贴在添加乳糖选择培养上,37℃培养24h，能形成特征菌落需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中总大肠菌群方法。培养条件：37℃24±2h微生物指标和微生物检验第7页酶底物法酶底物法定义：总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出众原体使培养基展现颜色改变，以此技术来检测水中总大肠菌群方法。培养基：MMO-MUG培养基（MinimalMediumONPG-MUG）。本方法可分为定性和定量。定量法：10管法、51孔定量法

培养条件：36±1℃24h

能产生β-半乳糖苷酶细菌群组分解ONPG使培养基呈黄色酶底物法主要特点：优点：可同时判断水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌检测时间较短，只需18-24h，最长需要28h无需确证试验操作简单，对试验条件和人员要求低缺点：检测成本高微生物指标和微生物检验第8页总大肠菌群三种方法比较多管发酵法滤膜法酶底物法时间24-72h24-48h24-28h验证试验需要需要不需要步骤较繁较简便简便特殊设备显微镜显微镜、过滤设备压膜机价格低低较高微生物指标和微生物检验第9页三、耐热大肠菌群（埃希氏菌属、耐热克雷伯氏菌）检测方法：多管发酵法、滤膜法修订前修订后原理：用提升培养温度方法将自然环境中大肠菌群与粪便中大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长大肠菌群,称为粪大肠菌群。定义：用提升培养温度方法将自然环境中大肠菌群与粪便中大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长大肠菌群,称为耐热大肠菌群。微生物指标和微生物检验第10页四、大肠埃希氏菌检测方法：多管发酵法、滤膜法、酶底物法大肠埃希氏菌多管发酵法定义：大肠埃希氏菌是指多管发酵法总大肠菌群阳性，在含有荧光底物培养基上44.5℃培养24h产生β-葡萄糖酫酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌方法。培养基：EC-MUG（4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖酫酸苷）。培养条件：44.5±0.5℃培养24±2h。紫外灯：波长366nm，功率6W大肠杆菌能产生β-葡萄糖酫酸酶分解MUG，菌落在366nm紫外光下产生蓝色荧光滤膜法定义：用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性滤膜在含有荧光底物培养基上培养，能产生β-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠埃希氏菌方法。培养基：NA-MUG培养条件：36±1℃培养4h紫外灯：波长366nm，功率6W微生物指标和微生物检验第11页酶底物法定义：在选择培养基上能产生β-半乳糖苷酶分解色原底物释放出众原体使培养基展现颜色改变，并能产生β-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃希氏菌方法为大肠埃希氏菌酶底物法。培养基：ONPG-MUG结果判定：水样变黄色同时在366nm紫外光下产生蓝色荧光为阳性。水样未变黄色而有蓝色荧光产生不能判定为阳性。微生物指标和微生物检验第12页五、贾第鞭毛虫子和隐孢子虫贾第鞭毛虫和隐孢子虫是一类寄生于人和动物体内肠道原虫，可致人兽共患病。患此病人和动物从粪便中排出大量卵(孢)囊污染环境，在地面水和防护差地下水及处理不良自来水中都可检出卵(孢)囊。伴随社会发展，优质供水势在必行。对一些潜在危险原因加以限制很有必要。在此基础上，新标准中增加了贾第鞭毛虫和隐孢子虫检测方法。微生物指标和微生物检验第13页Cryptosporidium隐孢子虫特点:单一细胞原生动物，约3-7m。有微小隐孢子虫、鼠隐孢子虫和贝氏隐孢子虫三种，寄生于人、牛等体内主要为微小隐孢子虫（C．parvum）。宿主：人类、鸟类、鼠类、爬行类、鱼类感染源:隐孢子虫主要寄生在被感染动物体肠道内，卵囊经过粪便排出体外污染环境。易感人群：免疫缺点者（如爱滋患者）、儿童、老人、医务人员等传输方式:以粪-口，手-口路径为主，污染水源和空气均可传输。微生物指标和微生物检验第14页Cryptosporidium隐孢子虫生活周期子孢子滋养体Ⅰ型裂殖体裂殖子Ⅱ型裂殖体雌、雄配子体合子成熟卵囊裂殖子微生物指标和微生物检验第15页Cryptosporidium隐孢子虫(染色后荧光显微镜下)微生物指标和微生物检验第16页特点:单一细胞原生动物，大小约10-15m，含4对鞭毛和双核。人、动物共染。寄生人体内为蓝氏贾第鞭毛虫Giardialamblia。在不一样温度和纬度地域均能发觉该病；发达国家感染率为2-5%；发展中国家感染率可高到达20-30%。可引发急慢性腹泻、肠吸收紊乱及延缓儿童生长发育。传染源：被孢囊污染水和食物；往往一人带孢囊全家感染；传输:经过被污染水和食物经口传输；接触（往往一人带孢囊全家感染）；娱乐用水；旅游。易感人群：3岁以内婴儿；免疫功效受损害者；旅游者。Giardia贾第鞭毛虫微生物指标和微生物检验第17页主要动物宿主贾第鞭毛虫在自然界广泛存在，包含两栖动物；鸟类；哺乳动物在内40各种动物均可成为贾第鞭毛虫宿主。调查表明，人排出孢囊可使狗、海狸、麝鼠、沙土鼠及大鼠等动物感染。一些生活在水中动物可被起源于人贾第鞭毛虫孢囊感染，所以这些动物即使不是主要宿主也可能作为贾第鞭虫传输媒介。微生物指标和微生物检验第18页Giardia贾第鞭毛虫微生物指标和微生物检验第19页两虫感染特点贾第氏鞭毛虫(Giardia)/隐孢子虫(Cryptosporidium)/感染后无特殊临床症状,无预防疫苗，绝大多数抗生素无效，治疗依赖于本身抵抗力大部份作为源水江河及水库水等地表水是高危,大部分地下水都有被地表水污染潜在危险能够经过被污染源水而进入供水系统,水源性感染已成为最大感染源，但孢/卵囊对传统水处理法中氯化消毒有抗性,氯不能渗透过卵囊，沙滤及膜过滤法也不能完全去除

饮用水高温煮沸也并非有效对氯消毒耐受、对热敏感、感染剂量低、感染率高微生物指标和微生物检验第20页隐孢子虫感染案例

1993年在美国威斯康星州东南部港口城市密尔沃基暴发400,000人被Cryptosporidium感染，4,000人到医院就医，60人死亡。调查显示致病源为处理不慎饮用水。

1996年美国CDC将Cryptosporidium感染列入国家必须申报传染病名单，将Giardia感染列入国家必须申报传染病名单—U.S.EPA微生物指标和微生物检验第21页两虫检测方法（免疫磁分离荧光抗体法）检测程序：水样过滤洗涤离心免疫磁珠捕捉卵囊磁珠与卵囊复合物分离荧光标识和DAPI染色显微镜检查记述结果汇报检测问题：方法操作复杂检出率低无法进行生物活性判定不能进行属、种判定价格高微生物指标和微生物检验第22页IDEXXFilta-Max®

手动/自动系统－滤器及滤芯FiltaMaxXpress快速系统-滤器及滤芯过滤器滤芯微生物指标和微生物检验第23页Filta-Max:滤芯结构（手动/自动法）

60层环状海绵:55mmx10mm

(18mm中孔)从60cm压缩成3cm螺栓固定Filta-Maxxpress:快速法滤芯结构40层海绵:55mmx10mm(18mm中孔)39层海绵:40mmx10mm(18mm中孔)交互叠放从79cm压缩到3cm螺栓固定微生物指标和微生物检验第24页水样流向1.水样过滤水样从两侧流经压缩海绵膜聚集至中孔“两虫”在滤芯表面被捕捉滤器连接套件滤器滤芯（过滤模块）微生物指标和微生物检验第25页

洗涤管滤芯置于洗涤管,并将滤芯下部压缩固定锣栓解除周律性地压缩/扩展海绵滤芯2.洗涤(淘洗)滤芯微生物指标和微生物检验第26页洗涤(淘洗)装置Filta-Max®手动淘洗装置Filta-Max®自动淘洗装置FiltaMaxXpress快速淘洗装置过滤器500ml锥形离心瓶微生物指标和微生物检验第27页Filta-Maxxpress快速法淘洗流程

滤器（带滤芯）放入淘洗装置淘洗装置连接缓冲液及空气压缩机加4.0巴(58psi)压缩空气按动F1钮2分钟后搜集400ml淘洗液快速全自动压缩空气滤器＋滤芯淘洗液搜集微生物指标和微生物检验第28页1.将装有淘洗液样本500mL离心管置g离心力下，离心15min。慢慢地减速，（不能使用制动装置！）以免搅起沉淀物。

2.用吸气装置将沉淀物上层8-10mL处悬浮物小心吸出

（吸气装置真空应小于3.3kPa）。3.离心浓缩微生物指标和微生物检验第29页4.免疫磁珠捕捉捕捉原理:

标识A抗体磁珠含有A抗原C/G

DYNALMIX1混合器MPC-1磁极MPC-S磁极微生物指标和微生物检验第30页5.免疫磁珠与孢（卵）囊复合物分离60min5min10min染色镜检微生物指标和微生物检验第31页6.染色及镜检单克隆免疫荧光染色（FA-异硫氰酸荧光素）或DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色荧光显微镜（DifferentialInterferenceContrast,DIC）微生物指标和微生物检验第32页

隐孢子虫贾第鞭毛虫两虫单抗染色结果微生物指标和微生物检验第33页隐孢子虫单克隆抗体染色结果微生物指标和微生物检验第34页隐孢子虫DAPI染色结果微生物指标和微生物检验第35页贾