实验大肠杆菌的培养和分离emma

菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有一定形态结构等特征的子细胞的群落。

不同微生物形成的菌落具有不同的特征（形态、突起、边缘），是鉴定菌种的重要依据。酵母菌放线菌霉菌大肠杆菌目前一页\总数二十六页\编于十八点大肠杆菌（E.coli）分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、污水、土壤、谷类、乳制品等当中。大肠杆菌在人体的_____中一般对人体无害，但任何大肠杆菌如果进入__________都会对人体产生危害。大肠杆菌是_______工程中被广泛采用的工具。肠道泌尿系统基因革兰氏______（填阴或阳）性菌阴代谢类型：异养，兼性厌氧型生长适宜温度：质粒、EcoRⅠ限制酶、E.coli-DNA连接酶、受体细胞37℃左右目前二页\总数二十六页\编于十八点实验一大肠杆菌的培养和分离1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的分离,用固体平板培养基进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理实验目的LB液体（固体）培养基目前三页\总数二十六页\编于十八点一、配制培养基培养基：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。水、碳源、氮源、无机盐、生长因子(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)1、成分区别于动物培养与植物培养：不加激素固体培养基与液体培养基的区别：琼脂成分作用主要来源碳源主要作能源物质无机碳(CO2)或有机碳(糖类)氮源合成含N类化合物N2，NH3，铵，硝酸盐尿素，牛肉膏，蛋白胨无机盐调节渗透压等水生长因子调节促生长维生素，AA，碱基等如NaCl目前四页\总数二十六页\编于十八点一、配制培养基不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方实例：“细菌喜荤，霉菌喜素”

细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁调节pH真菌：5～6细菌：6.5～7.5溶解计算称量调pH分装加塞，包扎灭菌2、过程勿沾到瓶口或者壁上，易污染，则作废目前五页\总数二十六页\编于十八点二、包器材封口膜通空气不通细菌牛皮纸或报纸加盖后几个包在一起接种环包牛皮纸P20①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用__________。②加塞：试管用塑料盖或________；三角瓶口用_______或_________封口,再用_________或报纸封口。③包扎：用________或报纸三角漏斗棉花塞封口膜6层纱布牛皮纸牛皮纸250ml装50ml目前六页\总数二十六页\编于十八点三、灭菌定义：以化学剂或物理方法消灭所有微生物（包括芽孢(休眠体)和孢子（真菌、放线菌生殖细胞））方法1：高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃下维持15min（培养基、无菌水、玻璃器皿等灭菌。P20），灭菌前排出锅内冷空气，因为空气膨胀压大于水蒸气膨胀压，达不到水蒸气的温度。灭菌锅压力与大气压相同时打开锅盖灭菌后，通常将实验用具放进60～80℃的烘箱中烘干，除去灭菌时的水分，防止污染(P20)方法2：干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。玻璃器皿等耐热器具恶劣环境下目前七页\总数二十六页\编于十八点四、超净台操作

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止________污染（培养基和操作者）的方法。杂菌1、紫外消毒（针对空气）：实验用具放在超净台上，打开超净台的紫外灯和过滤风（人离开）30min左右，培养基冷却至60℃，关闭紫外。2、酒精消毒：用镊子取出酒精棉擦拭超净台桌面，并擦拭双手。3、开始实验_________必须无菌（灭菌）_________也必须要无菌（灭菌）_________时不带入杂菌（灭菌、消毒各种器具培养基转移菌种灭菌与消毒的区别目前八页\总数二十六页\编于十八点灭菌与消毒的区别消毒：使用较温和理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的微生物的过程。不能杀死芽孢和孢子。（对被消毒物体基本无害）灭菌：使用强烈的理化因素消灭物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。（细菌蛋白质变性达到灭菌目的）例题：请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。无菌操作消毒灭菌①高压蒸汽灭菌②干热灭菌③灼烧灭菌①紫外线消毒法（使蛋白质变性，还能损伤②化学药剂消毒法（酒精）③煮沸消毒法400~500℃70%DNA结构④巴氏消毒法目前九页\总数二十六页\编于十八点四、超净台操作倒平板制斜面：冰箱4℃保存单菌落在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶中培养基（10~20ml）倒在培养皿里，将其放于水平位置，轻轻晃动，使培养基铺满底部，凝固形成平面。倒置放置既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。目前十页\总数二十六页\编于十八点思考题：A、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3、整个操作在酒精灯火焰旁进行4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。B、培养基灭菌后，需要冷却到60后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。目前十一页\总数二十六页\编于十八点思考题C、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。D、如何检查培养基是否受杂菌的污染？将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。目前十二页\总数二十六页\编于十八点四、超净台操作接种扩大培养从大肠杆菌斜面→锥形瓶中的液体培养基接种好后在37度摇床振荡培养12h注意事项:1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原.目前十三页\总数二十六页\编于十八点四、超净台操作划线分离法原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。由于划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此最后部分的细菌间距加大。获得单菌落首尾注意事项:1.接种环灼烧灭菌后要冷却，避免温度高杀死菌种1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次,不能划破培养基.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养37℃，12~24h目前十四页\总数二十六页\编于十八点第一区域第二区域第三区域第四区域第五区域注意1:不能出现线条的重叠注意2:第二次或随后几次的操作总是从上一次划线的末端开始注意3:最后一个区域不能与第一个区域相连目前十五页\总数二十六页\编于十八点

平板划线接种灼烧接种环冷却划线（第一区域）蘸取菌液灼烧接种环冷却划线（第二区域）灼烧接种环冷却划线（第三区域）灼烧接种环冷却划线（第四区域）灼烧接种环冷却划线（第五区域）灼烧接种环平板倒置放置培养目前十六页\总数二十六页\编于十八点第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次划线结束后接种环上的残留菌种杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境或感染操作者在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。单菌落分离的标志？划线的末端出现不连续的单个菌落为什么要倒置培养？既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成细菌随水扩散污染，难以分成单菌落，达不到分离的目的目前十七页\总数二十六页\编于十八点1、系列稀释操作四、超净台操作涂布分离法2、涂布平板操作玻璃刮刀目前十八页\总数二十六页\编于十八点细菌的分离方法划线分离法和涂布分离法。

种类:作用:单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。

划线分离法，简单方便；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些目前十九页\总数二十六页\编于十八点单菌落培养试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱中保存目前二十页\总数二十六页\编于十八点分析与讨论:1、如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？（1）胆大心细，操作快捷（2）注意灭菌操作原则，灭菌要彻底，尽量降低环境污染几率，手和实验服要保持清洁，合理地减少操作时间，对污染源的改善要考虑周到（3）注意微生物的生长条件，如pH、渗透压、温度等。细菌喜中性偏碱性环境，喜蛋白质丰富的物质营养，喜37℃的温度；而霉菌喜中性偏酸性环境，喜糖类丰富的物质营养，喜25-30℃的温度。不仅考虑培养基成分，也要考虑理化性质：pH、渗透压、温度、氧气等目前二十一页\总数二十六页\编于十八点分析与讨论:2、在培养后如何判断是否有杂菌污染？（1）从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标（2）用显微镜镜检观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标（3）上述方法较难区分同类的不同菌种，这时就需要借助化学方法和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法，观察孢子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、有无鞭毛、芽孢、毒素及特异生理生化性质等目前二十二页\总数二十六页\编于十八点分析与讨论:3、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？完成实验后，所有接触过细菌的器皿都必须先经过高压灭菌后再洗涤，特别是培养基有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体会影响人畜健康，也会污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要经过高压灭菌后再丢弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤30min，再永清水洗净，仍可再用。封口膜也可重复使用。目前二十三页\总数二十六页\编于十八点分析与讨论:4、如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通的大肠杆菌所污染？转基因用的质粒，不是细菌中原有的质粒，而是通过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，如抗氨苄青霉素基因。转基因载体（质粒）转化进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未被转化的就不能生长，其它没有抗氨苄青霉素基因的杂菌也不能生长，这种设计保证了转基因工程菌的纯洁性。在获得转基因工程菌后，如果为了选择高表达量菌株等进行分离，也可使用含抗生素的培养基，这就保证了转基因工程菌不被普通（无抗性基因）的大肠杆菌所污染。目前二十四页\总数二十六页\编于十八点请回答下列酵母菌有关的问题：

（1）从生态系统的成分上看，酵母菌属于

，它的同化作用类型是

。（2）培养酵母菌时，为防止杂菌污染需要对培养基和培养皿进行

。（3）酵母菌菌种A能耐高温，但产酒精率较低，而菌种B不耐高温，产酒精率却较高。利用细胞工程课获得耐高温、产酒精率高的融合子酵母菌（目的菌种），利用A、B两菌种对某一药物抗药性的差异，可对融合子进行筛选。实验中，应将含有融合子的培养液利用

方法接种到含有相关药物的基本培养基上。下表为A、B两菌种在几种药物的作用下，生长状况的实验结果。由于A种不能独立在基本培养基上生长，所以，据表可以判断，加入

（药物），可以筛选出融合子。 注：“+”可以良好生长，“一”不能生长。多菌灵三唑酮霜霉狂杀放线菌酮菌种A+