基于性细胞的转基因动物

主要内容第一节雄性生殖干细胞的概况第二节与传统的动物转基因方法的比较第三节睾丸注射技术目前一页\总数四十三页\编于八点第一节、雄性生殖细胞的概况对于基因转移研究来说，雄性生殖细胞很明显的优于雌性生殖细胞。研究雌性生殖细胞更加困难，胚胎形成后，从最初的几个阶段一直到减数分裂，生殖细胞的数量有限，减数分裂在受精时就已经结束了，而雄性细胞则不存在这样的问题。目前二页\总数四十三页\编于八点一、精原干细胞的概念精原干细胞（Spermatogonialstemcell，SSCs）是雄性动物体内唯一可以将遗传信息传递给后代的成体干细胞，其有自我更新和分化为精子的能力。利用精原干细胞可以诱导生成雄性生殖干细胞（mGSCs）目前三页\总数四十三页\编于八点二、精原干细胞的概况理论上讲一个精原干细胞携带有外源DNA，可生成多个阳性的子细胞，随着分裂还可生成更多带有外源DNA的精子，而这些精子与卵子结合后即可产生转基因动物个体，这种放大效应是其他转基因方法无法比拟的．因此，利用精原干细胞进行转基因动物的制作成为目前各国在转基因研究领域的热点之一目前四页\总数四十三页\编于八点三、精原干细胞的发育过程对于雄性哺乳动物而言，精原干细胞的形成经历了一个复杂的发育过程。当精子与卵子结合形成受精卵，受精卵经过卵裂发育成囊胚，再由囊胚发育为内胚层、中胚层和外胚层。生殖干细胞起源于外胚层，一些外胚层细胞从尿囊出发迁移到生殖脊，在此处发育为原始生殖细胞(PGCs)。原始生殖细胞被支持细胞(Sertoli细胞)的前体细胞包围，形成精索(seminiferouscords)。精索形成后，PGCs随着形态的变化而发育成为性原细胞(gonocytes)，性原细胞在动物出生后，逐渐发育为精原干细胞。目前五页\总数四十三页\编于八点四、精原干细胞的分离与纯化在小鼠睾丸内的全部生殖细胞中,仅有0.

03%是干细胞,因此对SSCs进行分离和纯化是关键的一步。根据SSCs与曲细精管细胞悬液中体细胞(支持细胞及少量的管周细胞)及其它各级分化的生精细胞在贴壁能力、比重、表面标志以及生长特性等方面的差异,目前较常用SSCs的纯化方法有以下几种。

1、差异贴壁法

2、免疫磁珠分离技术

3、流式细胞术分选

4、基于细胞形态的筛选目前六页\总数四十三页\编于八点四、精原干细胞的分离与纯化差异贴壁法先将曲细精管细胞悬液接种在明胶处理的培养皿中,体细胞贴壁的速度远远超过SSCs,大部分体细胞短时间即可贴壁,过夜培养后,体细胞大多完成贴壁,而SSCs尚未贴壁,或贴壁不牢,轻轻吹打即脱落,将之吸到另一个培养皿可富集培养。研究证明,层粘连蛋白(laminin)可被用来富集SSCs,层粘连蛋白是生精小管基底膜细胞外基质主要成分之一。曲细精管细胞悬液接种在层粘连蛋白处理过的培养皿中,SSCs首先贴壁,去掉未贴壁细胞,将贴壁细胞收集即可得到纯化的SSCs。差异贴壁法是将以上两种差异贴壁的方法结合起来,先将得到的大鼠曲细精管单细胞悬液接种到100mm培养皿中,让大部分的体细胞完全贴壁,将未贴壁细胞转移到胶原包被的培养皿中,让大部分分化的精原细胞贴壁,再将未分化的细胞转移到层粘连蛋白包被的培养皿中,贴壁的细胞大多数为未分化的精原细胞。目前七页\总数四十三页\编于八点五、雄性生殖干细胞的获得雄性生殖干细胞（mGSCs）起源于原始生殖细胞(Primordialgermcells,PGC),存在于新生和成年哺乳动物睾丸内,是精子发生的基础,能够进行自我更新并能分化为子代的精原细胞。采用机械法和2步酶消化法分离出成年昆明小鼠的精原细胞,经差速贴壁后,培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上,2周后得到类胚胎干细(ESCs)样mGSCs。目前八页\总数四十三页\编于八点五、雄性生殖干细胞的获得mGSCs细胞生长图A.分离培养的精原细胞(200倍);B.精原细胞的克隆(200倍);C.mGSCs第1次传代后形成的ESCs样克隆(50倍);D.mGSCs第1次传代后形成的ESCs样克隆(200倍);目前九页\总数四十三页\编于八点五、雄性生殖干细胞的获得支持细胞饲养层上生长首页目前十页\总数四十三页\编于八点第二节、与传统转基因方法的比较转基因技术自创立以来，各国学者一直在努力寻求技术上的改进，从而达到提高动物阳性率的目的。目前常用的转基因方法有以下几种:①显微射法;②逆转录病毒感染法;③胚胎干细胞法;④核移植法;⑤精子载体法等。目前十一页\总数四十三页\编于八点一、显微注射法目前十二页\总数四十三页\编于八点一、显微注射法目前十三页\总数四十三页\编于八点一、显微注射法注射的细胞与周围未注射的细胞可以进行比较，这样可以排除由于培养环境与细胞反应的变异性引起的人为误差优点此方法耐受性比较好，可以成功地用在不同类型的培养细胞中目前十四页\总数四十三页\编于八点一、显微注射法缺点2缺点3缺点1最大的不足就是设备投入很大（如显微镜、微操作仪等）要做到在短时间内成功的微注射100个或100个以上的细胞，需要进行一定的实践有些类型的细胞，如非附着细胞，不适宜进行微注射目前十五页\总数四十三页\编于八点二、重组逆转录病毒载体法概念逆转录病毒介导的转基因方法是借助逆转录病毒DNA载体与外源基因重组后经包装细胞系产生缺陷型重组逆转录病毒,该病毒可以成功地感染靶细胞,将外源基因整合于染色体基因组中而得到转基因动物目前十六页\总数四十三页\编于八点二、重组逆转录病毒载体法目前十七页\总数四十三页\编于八点二、重组逆转录病毒载体法目前十八页\总数四十三页\编于八点二、重组逆转录病毒载体法目前十九页\总数四十三页\编于八点二、重组逆转录病毒载体法TextTextText优点我们用同样逆转录病毒在牛乳腺进行了稳定表达,其表达量是180mgPL牛奶,说明通过重组蚓激酶逆转录病毒实现转基因是可行的,操作方便,成本低等方面是其他方法所不及的。缺点它的不足之处是使精子数量减少或造成死胎,可能是在整合时发生突变等造成的。TextText目前二十页\总数四十三页\编于八点三、电脉冲法利用电穿孔仪可以将外源目的基因导入胚胎干细胞细胞或精原干细胞内制备转基因动物目前二十一页\总数四十三页\编于八点三、电脉冲法目前二十二页\总数四十三页\编于八点四、核移植法目前二十三页\总数四十三页\编于八点四、核移植法受精卵内导入外源基因的方法目前二十四页\总数四十三页\编于八点四、核移植法目前二十五页\总数四十三页\编于八点五、精子载体法精子载体法是将外源基因导入精子细胞内，使其携带外源基因，经过与雌性动物自然交配从而将目的基因传递给后代，最终获得转基因动物。目前二十六页\总数四十三页\编于八点第三节、睾丸注射技术目前二十七页\总数四十三页\编于八点一、睾丸内注射法的概念睾丸注射法就是将外源DNA直接注射到雄性动物睾丸内，转染各个发生阶段精子细胞，转染的精子经体内发育成熟后采用自然交配、人工辅助交配或人工授精方法获得转基因动物。目前二十八页\总数四十三页\编于八点一、睾丸内注射法的概念1利用睾丸注射方法将脂质体包被的外源基因注入睾丸内转染雄性生殖细胞，通过与雌性动物受精从而获得转基因动物。2此种方法所制备的雄体在相当长的时间内，能够随时受精，获得转基因动物阳性率也相对较高，从而降低了转基因动物制备的成本。3这种方法克服了成熟精子体外孵育转染效率低、电穿孔法导致受精率下降等缺点，并且对设备及实验者要求不高，可导入大片DNA，是一种简便且行之有效的方法。目前二十九页\总数四十三页\编于八点二、与传统转基因技术的比较成本低，安全性好安全性差，效率低效率低，影响动物探索阶段精原干细胞IPS细胞核移植胚胎干细胞目前三十页\总数四十三页\编于八点二、与传统转基因技术的比较精原干细胞可以通过两种方式来获得转基因动物一种方法是在体外培养使其逐渐转变为多能性生殖干细胞，再对多能性生殖干细胞进行基因组修饰，通过胚胎注射的方法获得含有生殖系转移的后代，再经过杂合体后代之间交配，从而获得纯种的转基因后代。目前在小鼠方面此方法仅有嵌合体后代的报道，尚无对多能性生殖干细胞进行基因组改造来产生转基因后代另一种方法是通过精原干细胞移植的方法来制作转基因后代，这种方法得益于小鼠及大鼠精原干细胞体外长期培养体系的建立以及睾丸注射方法的产生，从而能够在体外对精原干细胞进行长期培养，使得对其进行基因组改造得以实现，对将基因组改造后的精原干细胞进行药物筛选后，注射到除去内源精原干细胞的小鼠的睾丸的曲细精管内，启动外源精原干细胞的精子发生过程，与雌鼠交配后即可获得杂合体后代，再通过杂合体之间的交配就可获得纯种的转基因或基因敲除后代。目前三十一页\总数四十三页\编于八点二、与传统转基因技术的比较利用精原干细胞获得转基因小鼠目前三十二页\总数四十三页\编于八点三、精原干细胞的应用前景多能干细胞,例如胚胎干细胞,拥有分化成体内各种细胞和组织的潜能,并被再生医学认为是非常有前途的供体来源,但是由于胚胎干细胞来源的诱导多能干细胞一些伦理上的问题,使得这一前景变得渺茫,而的出现给广大的研究者带来了希望。诱导多能干细胞在形态、增殖和多能性方面与胚胎干细胞极其相似,但是由于诱导多能干细胞的不稳定性、反转录病毒的介导以及外源基因的插入,其中一些外源基因还是致癌基因,这使得其在临床上的应用暂时变得不可能。然而,SSCs可以不经过转基因操作就转变为多能干细胞,只需要添加一些生长因子进行诱导即可,而且与胚胎干细胞相比,利用自体SSCs来源的多能干细胞进行细胞水平上的移植可以避免异体排斥,因为供体和受体是同一来源的,还可以避免伦理上的问题.目前三十三页\总数四十三页\编于八点四、精原干细胞在再生医药方面的应用1、可以用来治疗遗传疾病:在患有遗传疾病的患者生育之前,将其SSCs在体外进行基因修复,再移植回体内,这样下一代将会远离这种因为基因缺陷而造成的疾病。2、可以恢复恶性肿瘤患者的生育能力:有的恶性肿瘤患者在经过放射治疗和化疗之后会丧失生育能力,若在治疗之前将该患者的SSCs进行体外的培养及冷冻,在肿瘤治好之后重新移植回体内可以帮助患者恢复生育能力。3、在再生医药方面的作用:利用SSCs可以转变为多能干细胞的特性,可以用该多能干细胞在体外诱导分化为各种需要的组织或器官为患者进行移植,治疗相关的疾病。4、还可以用来研究干细胞或多能干细胞分化潜能的信号通路,为更好地研究干细胞和从成体细胞诱导干细胞奠定基础。也许在不久的将来,男士们就可以通过自己睾丸的一个小小的切片来治愈自身的疾病。目前三十四页\总数四十三页\编于八点五、精子形成各阶段转基因效率的研究科学家对各试验鼠在注射后7、16、30和42天与发情母鼠交配后所得仔鼠中平均DNA印迹阳性率分别为6.82%、0、47.06%和34.69%注射后16天，对小鼠进行第二次合笼，结果未有转基因小鼠产生．该阶段是精子细胞变态形成精子的阶段，主要是单倍体的圆形精子细胞进行一系列的形态变化，最后形成具有头、颈、尾结构的完整精子．此时，精子细胞核内染色质中的组蛋白被富含精氨酸的鱼精蛋白取代，而鱼精蛋白中含有大量正电荷，吸引着带负电荷的DNA发生聚集根据细胞核的这一变化可以推测，此时期应该是外源基因较易进入细胞核基因组的时期，但本次试验结果却与之相反，未产生一只转基因小鼠．目前三十五页\总数四十三页\编于八点五、精子形成各阶段转基因效率的研究我们认为，可能由于精子细胞在精子形成过程中大部分细胞质成为残体(residualboduy)被抛弃，而此时外源基因可能在进入细胞后而还未进入细胞核就随细胞质一起被淘汰．在此阶段内是否还存在其他一些未知因素而导致外源基因无法进入精子细胞或细胞核内，从而使外源基因不能在该时期发生转染，还需要进行更深入的研究目前三十六页\总数四十三页\编于八点五、精子形成各阶段转基因效率的研究选择在公鼠交配前42天注射转染液，此时转染的正是精原干细胞及其有丝分裂阶段，而对处于有丝分裂期的细胞而言，由于核膜已经破裂，质粒DNA则容易进入核内．Kim等先用白消安(一种烷化剂)处理睾丸组织，以杀灭睾丸组织中发育的初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞，而精原干细胞和精原细胞不被杀灭，然后将脂质体和外源基因混合物注入小鼠曲细精管内，结果有8.0%～14.8%的新生成睾丸精子和7%～13%的附睾精子表达了外源基因，从而证明了用外源基因转染精原干细胞的可行性．目前三十七页\总数四十三页\编于八点六、睾丸注射转染的机理睾丸注射的转染机理包括两个方面:一方面,在做打点式注入时,进样器针尖将曲细精管划破,质粒/脂质体复合物从伤口处进入曲细精管,从而完成对生殖细胞的转染;另一方面,质粒/脂质体复合物通过注射进入睾丸的组织液中,通过体液循环到达曲细精管内,进而完成对生殖细胞的转染,当复合物注入睾丸后,引起睾丸内压力增大,这种渗透作用更加显著,促进了包裹后的质粒以上述两种机制完成对精原细胞、精母细胞及成熟精子的转染,这种渗透作用在其他学者的实验中也得到了证实目前三十八页\总数四十三页\编于八点六、睾丸注射转染的机理将外源基因直接注射到睾丸和附睾中转染各阶段的精子细胞,既避免了精清中的拮抗DNA结合的抑制因子的影响,又避免了体外孵育方法将外源DNA大多数吸附于精子头部表面等影响转基因效率不利的因素。目前精浆抑制DNA与精细胞的结合作用已得到广泛证实,拮抗DNA结合的抑制因子(inhibitionfactor,IF21)选择性地结合在精子核后帽区,与外源DNA结合的部位相同,它能置换出与DNA结合的30×103～35×103蛋白质。Huang等还发现精浆中存在Ca2+依赖性DNA酶,IF21和核酶可能是保持遗传稳定性,避免物种变异的保护性分子。正因为如此,睾丸内注射的外源DNA得以成功打破物种精子的保守性,并得到表达GFP的早期胚胎