免疫检测技术的基本原理专家讲座

免疫检测技术的基本原理专家讲座第1页免疫学检测技术优点高度灵敏性高度特异性免疫检测技术的基本原理专家讲座第2页免疫分析技术应用惯用诊疗技术血凝试验酶联免疫吸附试验胶体金免疫技术放射免疫分析技术免疫检测技术的基本原理专家讲座第3页凝集试验概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与对应抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见凝集物，称为凝集反应。1.直接凝集反应抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳性结果。①玻片直接凝集法：定性试验②试管直接凝集法：半定量试验免疫检测技术的基本原理专家讲座第4页试管法半定量试验YYY+

玻片直接凝集试验1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512免疫检测技术的基本原理专家讲座第5页2.间接凝集法先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上(如RBC,乳胶颗粒)，再与对应抗体或抗原反应，出现凝集为阳性结果。临床惯用有间接血凝试验、乳胶凝集试验等。YYY+→待检样品抗原吸附血球或乳胶颗粒反应凝集物免疫检测技术的基本原理专家讲座第6页3.间接凝集抑制试验先将待检抗原与已知抗体反应，再加入用已知抗原吸附载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。例：乳胶凝集抑制试验检测HCG(妊娠诊疗)YYY步骤1：将已知抗体与待检标本混匀＋YYY＋步骤2：加入抗原吸附乳胶颗粒混匀YYY抗原吸附乳胶颗粒结果判断：不凝集为阳性结果已知抗体待检标本免疫检测技术的基本原理专家讲座第7页凝集反应免疫检测技术的基本原理专家讲座第8页2.沉淀反应

概念：可溶性抗原与对应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。类型：★单向免疫扩散★免疫比浊法★双向免疫扩散★对流免疫电泳免疫检测技术的基本原理专家讲座第9页

单向琼脂扩散试验免疫检测技术的基本原理专家讲座第10页双向琼脂扩散试验免疫检测技术的基本原理专家讲座第11页

对流免疫电泳免疫检测技术的基本原理专家讲座第12页测吸光度计算抗原或抗体含量抗体抗原免疫复合物浓度与透射光衰减呈正相关免疫比浊法原理免疫检测技术的基本原理专家讲座第13页3.中和反应如抗“O”试验4.免疫标识技术概念：用荧光素、酶、同位素等标识抗体或抗原用以测定对应抗原或抗体技术称为免疫标识技术。惯用方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检测技术等。特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。免疫检测技术的基本原理专家讲座第14页免疫标识技术酶免疫标识技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术免疫金标识技术免疫检测技术的基本原理专家讲座第15页酶联免疫吸附试验1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)免疫检测技术的基本原理专家讲座第16页酶及其底物

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结产物。是ELISA成败关键试剂，它不但含有抗体抗原特异免疫反应，还含有酶促反应，显示出生物放大作用，但不一样酶选取不一样底物，将得到不一样颜色反应.免疫检测技术的基本原理专家讲座第17页酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

免疫检测技术的基本原理专家讲座第18页2、标识方法戊二醛交联法过碘酸盐氧化法免疫检测技术的基本原理专家讲座第19页戊二醛交联法(一步法）抗体-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗体酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶免疫检测技术的基本原理专家讲座第20页戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶免疫检测技术的基本原理专家讲座第21页过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环免疫检测技术的基本原理专家讲座第22页标识免疫物分离与判定1、分离目标：去除游离酶方法：盐析、柱层析2、判定抗体活性酶活性标识物纯度免疫检测技术的基本原理专家讲座第23页ELISA种类和改变

（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕捉法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素ELISA

免疫检测技术的基本原理专家讲座第24页免疫检测技术的基本原理专家讲座第25页（一）双抗体夹心法此法适合用于检验各种蛋白质等大分子抗原免疫检测技术的基本原理专家讲座第26页取得待分析物未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留蛋白结合位点洗涤并除去未结合封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其它未结合物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标识抗体复合物彻底洗涤未结合酶标抗体加底物进行酶催化反应依据颜色反应程度进行该抗原定性或定量测定免疫检测技术的基本原理专家讲座第27页

间接法是检测抗体最惯用方法，其原理为利用酶标识抗抗体以检测已与固相结合受检抗体，故称为间接法。（二）间接法免疫检测技术的基本原理专家讲座第28页酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法)免疫检测技术的基本原理专家讲座第29页包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使对应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合酶标抗抗体加底物显色依据颜色反应程度进行该抗原定性或定量测定免疫检测技术的基本原理专家讲座第30页（三）竞争法

此法可用于抗原和半抗原定量测定，也可用于测定抗体。免疫检测技术的基本原理专家讲座第31页用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合分别洗涤除去未结合成份加底物显色分别测定两管吸光度值，依据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量免疫检测技术的基本原理专家讲座第32页对照管因为只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合酶标抗原量降低。所以，加入底物后显色反应较弱。免疫检测技术的基本原理专家讲座第33页饲料中盐酸克伦特罗测定饲料中毒素测定（主要包含黄曲霉毒素，简曲霉毒素）饲料中有害微生物快速筛检（如沙门氏菌）甲胺磷残留分析甲基对硫磷残留分析呋喃丹残留分析ELISA在饲料安全检测中应用ELISA用于农药残留检测免疫检测技术的基本原理专家讲座第34页河豚毒素

植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘

主要有除草剂与杀虫剂两大类比如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。农药检测：免疫检测技术的基本原理专家讲座第35页食源性病原菌检测试剂盒大肠杆菌检测沙门氏菌检测单增李斯特菌金黄色葡萄球菌

免疫检测技术的基本原理专家讲座第36页转基因成份检测：如转基因玉米中中cry9e蛋白转基因大豆中CP4EPSPS蛋白质．肉制品掺假检测：以辣根过氧化物酶标识不一样动物肌肉和血清球蛋A抗血清检验牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测14种畜禽熟肉制品，包含牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在掺假率为1%时即可检出食品其它检测：免疫检测技术的基本原理专家讲座第37页荧光抗体技术原理与方法

用荧光素标识抗原或抗体，再与标本中抗体或抗原反应，然后在荧光显微镜下观察，形成IC可散发出荧光，对标本中抗原或抗体进行测定和定位。惯用荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)等。惯用方法直接荧光法间接荧光法免疫检测技术的基本原理专家讲座第38页免疫荧光技术免疫检测技术的基本原理专家讲座第39页免疫荧光技术——直接法AgY荧光素标识特异性抗体组织切片免疫检测技术的基本原理专家讲座第40页免疫荧光技术——间接法AgYY荧光素标识抗抗体组织切片待测抗体免疫检测技术的基本原理专家讲座第41页免疫荧光技术免疫检测技术的基本原理专家讲座第42页荧光显微镜免疫检测技术的基本原理专家讲座第43页荧光显微镜使用原理激发滤片（BG）吸收滤片（OG）标本FITC吸收光峰值：490-495nmFITC发射光峰值：520-530nmBG：325-500OG：410-650免疫检测技术的基本原理专家讲座第44页免疫金标识技术免疫金标识技术(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金颗粒含有高电子密度特征，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标识物在对应配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量快速免疫检测。这一反应也能够经过银颗粒沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。免疫检测技术的基本原理专家讲座第45页一、胶体金制备

胶体金（colloidalgold）制备普通采取还原法，惯用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度金溶液内加入一定量还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（goldsolution）。免疫检测技术的基本原理专家讲座第46页

胶体金制备及特征胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特征（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙红色522411.00红色52571.50.70紫色535*还原100ml0.01%HAuCl4所需量免疫检测技术的基本原理专家讲座第47页胶体金（ColloidalGold）

15~60nm优质劣质免疫检测技术的基本原理专家讲座第48页胶体金结合物（Conjugate）免疫检测技术的基本原理专家讲座第49页一、免疫渗滤测定(IFA)免疫检测技术的基本原理专家讲座第50页

斑点渗漏法

其原理与层析法相类同，中心圆点为一株单抗，边上小点为抗鼠二抗。先将待测样品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆点，洗去未结合抗原，再滴加金标另一株单抗，若有抗标准形成金-Ab-Ag•薄膜红色斑点，而边上是金-Ab-Ab2•薄膜质控点，是为金标二步法。

免疫检测技术的基本原理专家讲座第51页IFA——双抗体夹心法测抗原AB免疫检测技术的基本原理专家讲座第52页IFA——结果判断免疫检测技术的基本原理专家讲座第53页二、免疫层析测定（ICA）免疫检测技术的基本原理专家讲座第54页层析法将金标一株单抗吸附于下端玻璃纤维纸上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解，并随尿液上行，若尿中有对应抗原，既形成Ag-Ab-金复合物，当上行至中段醋酸纤维薄膜，即与下端另一株单抗结合并被固定下来，显示阳性结果。其上方还有一条抗鼠二抗，待红色金标单抗上行此处即被固定下来，作为金标单抗质控提醒。此种方法称金标一步法。免疫检测技术的基本原理专家讲座第55页

兔抗鼠IgG鼠抗HCG单抗金标鼠抗HCG单抗尿液浸湿标志线手持端斑点金免疫层析试验（一）免疫检测技术的基本原理专家讲座第56页斑点金免疫层析试验（二）尿样阳性弱阳性阴性无效质控线测试线免疫检测技术的基本原理专家讲座第57页

ICA——双抗体夹心法测抗原免疫检测技术的基本原理专家讲座第58页ICA---竞争法测抗原免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图免疫检测技术的基本原理专家讲座第59页ICA竟争法结果观察

阴性阳性无效免疫检测技术的基本原理专家讲座第60页ICA——间接法测抗体免疫检测技术的基本原理专家讲座第61页ICA结果观察

阳性阴性无效免疫检测技术的基本原理专家讲座第62页IFA与ICA比较IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保留4~8℃6个月室温一年操作步骤3~51观察时间3min3~20min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐步加深免疫检测技术的基本原理专家讲座第63页IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA横流（LATERALFLOW）免疫检测技术的基本原理专家讲座第64页1、罗立新,缪珑,潘力,等.快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法研究[J].中国卫生检验杂志,,16(2):154-156.2、赖卫华,熊勇华,陈高明,等.应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A研究[J].食品科学,,26(5):204-207.免疫检测技术的基本原理专家讲座第65页3、谌志强,段惠莉,王新为,等.大肠埃希菌O157:H7胶体金免疫渗滤法检测[J].中国公共卫生,,21(4):705-706.4、谢昭聪,宋志强,吕敬章,等.应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌研究[J].中国国境卫生检疫杂志,,28(3):163-165.免疫检测技术的基本原理专家讲座第66页5、王中民,李君文,王新为,等.免疫金渗滤试验检测食品中沙门氏菌研究[J].微生物学免疫学进展,,29(4):45-47.6、刘永德,汪毅,陈禹雷,免疫金探针快速检测禽流感病毒研究[J].上海交通大学学报:农业科学版,,23(3):321-324.免疫检测技术的基本原理专家讲座第67页斑点金免疫渗滤试验ADCB阴性（未怀孕）阳性（怀孕）加尿样除去滤器加胶体金标识抗体加洗涤液结果判定免疫检测技术的基本原理专家讲座第68页免疫印迹法图解SDS裂解病毒聚丙酰胺凝胶电泳-+95684512KD电转印至NC膜上置待测血清中，漂洗；加酶标抗抗体，漂洗；加底物显色1204124KD免疫检测技术的基本原理专家讲座第69页

第四节放射性核素标识技术一、惯用标识方法二、标识免疫物分离与纯化免疫检测技术的基本原理专家讲座第70页R：放射性核素示踪高灵敏不直接探测待测物，而探测待测物上标识信号(标识物放大效应)I：免疫学反应高特异废除以往沿用无机或有机试剂，代之以抗体为结合剂免疫检测技术的基本原理专家讲座第71页惯用标识方法1、惯用放射性核素2、125I标识方法直接法（氯胺T法）间接法（连接法）免疫检测技术的基本原理专家讲座第72页直接法（氯胺T法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I4。C125I氯胺T免疫检测技术的基本原理专家讲座第73页间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP免疫检测技术的基本原理专家讲座