溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座

溶菌酶制备、蛋白质测定及该酶比活力测定Lysozymepreparation,proteindeterminationandthedeterminationofenzymespecificactivity生物制药工艺学期末考评讨论：汇报人：（0834110）08届食品学院制药1班.4.29溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第1页溶菌酶起源：1922年一天，正在感冒英国细菌学家AlexanderFleming发觉，把一些鼻粘液加入细菌培养基后会引发细胞溶解。而这种存在于鼻粘液中能杀死细菌主要物质被认为是一个酶，Fleming命名其为溶菌酶（Lysozyme）。那时，溶菌酶不能证实有临床价值。不过在酶机制研究学习方面，溶菌酶饰演了一个很主要角色。溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第2页溶菌酶结构在1965年,DavidPhillips和他在牛津同事以0.2nm分辨率X射线晶体（X-raycrystallography）结构分析法说明了溶菌酶三维结构(tertiarystructure)。溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第3页溶菌酶作用机制：溶菌酶是一个N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，该酶能够催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，造成细胞壁破裂，使内容物溢出而是细菌溶解，妨碍致病细菌活性繁殖，并杀死细菌。溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第4页溶菌酶制备试验原理试验材料、试剂及仪器试验步骤试验看法溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第5页溶菌酶制备本试验主要是以鸡蛋清作为试验材料，采取D152型树脂柱层析法除去杂蛋白及等电点法提取溶菌酶粗品溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第6页溶菌酶制备：鸡蛋清中约含有0.3％溶菌酶，分子量为14，000，等电点为11.1，最适溶菌温度为50℃，最适pH值为7。鸡蛋清溶菌酶化学性质非常稳定，当pH值在1.2～11.3范围内猛烈改变时，其结构仍稳定不变，遇热时该酶也很稳定，在pH4～7范围内，100℃处理lmin，仍保持原酶活性。但在碱性环境中，该酶对热稳定性较差。其一级结构由129个氨基酸残基组成一条多肽链，其稳定性主要与多级结构中4对二硫键、氢键及疏水键相互作用。人溶菌酶溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第7页溶菌酶制备试验主要仪器、材料及试剂：（一）主要仪器：

高速冷冻离心机、恒流泵、部分搜集器（二）材料及仪器：

D152大孔弱酸性阳离子交换树脂，新鲜鸡蛋，0.1mol/L磷酸盐缓冲剂，pH7.0,氯化钠，硫酸铵，0.5mol/LNaOH,0.5mol/LHCl,层析柱（2.6cm*30cm）,无水乙醇，聚乙二醇溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第8页溶菌酶制备试验步骤：蛋清样品制备：

取出蛋清，加入1.5倍体积0.1mol/L磷酸盐缓冲剂，搅拌均匀，将pH值调至8左右，然后用八层纱布过滤，去滤液，量取体积并统计。溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第9页溶菌酶制备试验步骤：阳离子交换层析制备：1、D152树脂处理：将D152树脂先将蒸馏水洗去杂物，滤除，用1mol/LNaOH搅拌浸泡并搅拌4~8h，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗近pH7.5左右，抽滤干，再用1mol/LHCl按上述方法处理树脂，知道全部转变为氢型，抽滤干HCl，用2mol/LNaOH处理树脂，是指转变为钠型，pH值不低于6.5。吸干溶液，加0.02mol/L磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。2、装柱：取直径为2.6cm，长度为30cm层析柱，自顶部注入经处理过上述树脂悬浮液，关闭层析柱出口，带树脂沉降后，放过量溶液，再加上一些树脂，至树脂沉积至15~20cm高度即可。与柱子顶部继续加入0.02mol/L磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。最终是流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持页面高出树脂表面1cm。溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第10页溶菌酶制备装柱吸附：将上述蛋清液仔细加入到树脂顶部，打开出口使其迟缓流如注内，流速为1ml/min。去杂蛋白：取出树脂，用柱平衡液洗去树脂上可能有杂蛋白。在手机洗脱液过程中，逐管用紫外分光光度计检测杂蛋白洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/LNaClpH值6.5、浓度为0.02mol/L磷酸钠缓冲液洗脱搜集洗脱液！聚乙二醇浓缩：将上诉洗脱液合并装入透析袋内，至容器外，外面附以聚乙二醇，容器加盖。酶液中水分很快就透析到膜外，被聚乙二醇所吸收。然后所得浓缩液之后透析袋用蒸馏水洗去透析袋膜外聚乙二醇！小心取浓缩版溶菌酶溶液溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第11页试验看法：与教科书P488页制备方法不一样是：教材所选取吸附方法使用磁力搅拌器搅拌蛋清液和树脂，个人以为此方法能够用于样品较小情况下，大约在300毫升以下！溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第12页溶菌酶活力、蛋白浓度测定试验原理试验仪器、材料及试剂试剂配制试验步骤溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第13页溶菌酶活力、蛋白浓度测定试验仪器、材料及试剂：（一）仪器：721分光光度计(二)材料及试剂：溶菌酶，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，溶壁微球菌干粉，氯化钠，考马斯亮蓝G-250,95%乙醇，85%磷酸，牛血清蛋白（BSA）溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第14页溶菌酶蛋白浓度测定试验原理：

棕红色染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色复合物最大吸光度由465nm变为595nm。在一定蛋白浓度范围内，蛋白和染料结合符合比尔定律。经过测定595nm处光吸收值增加量，可对蛋白质浓度进行定量测定。

溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第15页溶菌酶活力、蛋白浓度测定试剂配制：1、测活缓冲液：含30mmol/LNaCl0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.2。2、底物浓度：40mg溶壁微球菌干粉，荣誉100mL测活缓冲液中。3、考马斯亮蓝G-250试剂;考马斯亮蓝G-250100mL95%乙醇中，加入100mL85%盐酸，用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。4、标准蛋白质溶液，用含有0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0(缓冲液A)配制1mg/mL牛血清蛋白溶液。5、溶菌酶液配制：取上述试验中所取得溶菌酶粗品液，荣誉100mL测活缓冲液。溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第16页溶菌酶蛋白浓度测定试验步骤标准曲线测定：取14支试管按下表，分两组进行平行操作：管号0123456标准蛋白溶液/mL0.000.010.020.030.040.050.06缓冲液A/mL0.100.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝G-250/mL5.005.005.005.005.005.005.00摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A295溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第17页溶菌酶蛋白浓度测定按上表数据，以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。测定未知样品蛋白质浓度：测定方法同上。去适当未知样品提及，使其测定值在标准曲线线性范围内。依据所测定A595值，在标准曲线上查处相当于标准蛋白Laing，从而计算出未知样品蛋白质浓度（mg/mL）溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第18页溶菌酶蛋白浓度测定试验备注：

若样品浓度超出了标准曲线线性范围，则适当加以稀释，稀释至标准曲线线性范围之内浓度！溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第19页溶菌酶活力测定试验原理：本试验以溶壁微球菌为底物，经过测定细菌悬液浊度改变（OD600）来测定溶菌酶活性溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第20页溶菌酶活力测定酶活力测定：在室温下，取2个试管，分别在1号管中加入3.0mL测活缓冲液，2.5mL底物浓度；2号管中加入2.5mL测活缓冲液，2.5mL酶液。以2号管为对照，依据不一样反应时间内在721分光光度计上每隔30s测定1号650nm处吸光值。按以下表格统计是按结果：时间/s0306090120150180OD650溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定专家讲座第21页溶菌酶活力测定试验数据处理酶活力单位（U）：没在温室pH6.2条件下，OD650每分钟强大0.001为1个酶活力单位U。比活力=活力单位/mg蛋白依据测得结果，计算各步数据填入下表：组分体积/mL蛋白/mg*mL-1总蛋白/mL活力/U*mg-1比活