分子生物学研究技术简介

分子生物学理论的产生与发展有赖于其技术体系的建立与进步，有关分子生物学研究方法与手段方面的内容，在专门的书籍中都有详细的论述。出于对本书内容的系统性和完整性方面的考虑，只简要地介绍分子生物学研究中最常用的实验技术与手段，其中有些内容放在了相关的章节中(如质粒DNA的提取纯化、核酸的超速离心、凝胶电泳和分子杂交等在第2章)介绍。目前一页\总数一百五十七页\编于四点13.1DNA分子克隆的基本原理DNA重组技术兴起于20世纪70年代初期。1972年Berg等将λ噬菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入到SV40DNA中，首次构建了DNA重组体(recom-binant)。次年，Cohen和Boyer将细菌质粒通过体外重组后导入大肠杆菌，得到了基因的分子克隆(molecularcloning)，由此诞生了基因工程。目前二页\总数一百五十七页\编于四点基因工程是对携带有遗传信息的核酸分子进行设计、重组和加工的分子工程，包括基因的重组、克隆和表达。这个术语既可用来表示对特定基因的操作，也可泛指它所涉及的相关技术体系，其核心是构建重组体DNA，因此基因工程和重组体DNA技术有时是同义词。目前三页\总数一百五十七页\编于四点重组体DNA技术是指在体外将不同来源的DNA分子进行重新组合，并使它们在适当的宿主细胞中实现增殖表达的遗传操作。而基因工程技术是指在分子水平上进行操作，在细胞水平上实现表达，其过程主要包括获得目的基因片段，连入合适载体，转入受体系统，筛选重组子和表达外源基因五个步骤。目前四页\总数一百五十七页\编于四点其特点是：第一，不受亲缘关系的限制，打破了物种界限，把不同种类生物的遗传物质组合在一起，人为地将高等生物的基因(如人胰岛素基因)引入细菌，使其产生人胰岛素。第二，可以定向地改变生物的遗传特性，通过有目的的取得某种基因，并将该基因引进原本没有这种基因的生物体，改变后者的遗传特性；第三、增加目的基因的剂量。目前五页\总数一百五十七页\编于四点由于生物体内某些蛋白质或其他组分的含量稀少且难以纯化，使对这些物质的详尽分子结构分析极其困难或几乎不可能，更谈不上对它们的生物利用。利用分子生物学技术可以解决这一生物学上的难题。目前六页\总数一百五十七页\编于四点13.2用于基因克隆的工具酶

在基因克隆中常用的主要工具酶见图13-1。图中显示，这类酶大体分为：①将DNA切开的酶;②将四种碱基聚合的酶；③将DNA片段连接起来的酶；④DNA片段末端修饰的酶。这些酶的发现与应用使基因操作成为可能。目前七页\总数一百五十七页\编于四点目前八页\总数一百五十七页\编于四点目前九页\总数一百五十七页\编于四点目前十页\总数一百五十七页\编于四点13.2.1DNA限制性内切核酸酶1970年Smith等从流感嗜血杆菌中分离出特异切割DNA的限制性内切核酸酶，简称为限制酶。1971年Danna和Nathans用此限制酶切割SV40DNA。绘制出第一个DNA限制酶切图谱。此后数年从NNN菌中分离出了许多修饰性甲基化酶和限制性内切核酸酶。目前十一页\总数一百五十七页\编于四点1973年Smith和Nathans提出修饰一限制酶的命名法：取分离菌属名的第一个字母，种名的前两个字母，如有株名也取一个字母，当一个分离菌中不只一种酶时，以罗马数字表示分离出来的先后次序。修饰性甲基化酶标以M，限制酶标以R。例如，最初分离到的限制酶是第2个分离的酶，应称为R·HindII，但R通常省略不写；相应的甲基化酶则为M·HindII。又如从大肠杆菌中分离到的甲基化酶为M·EcoRI，限制酶为EcoR工(图13-2)。目前十二页\总数一百五十七页\编于四点目前十三页\总数一百五十七页\编于四点限制修饰系统主要有三类：I、Ⅱ、Ⅲ型。(1)I型限制修饰系统是第一个被发现，为多亚基双功能酶，对DNA的甲基化和切割由同一个酶完成。其甲基化及内切酶活性紧密偶联，两类反应均需ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。目前十四页\总数一百五十七页\编于四点

(2)Ⅱ型限制修饰系统修饰和限制活性由分开的两个酶完成。这类甲基化酶由一条多肽链组成，限制酶由两条相同的多肽链组成。其识别序列一般为4～6bp3的回文序列。目前十五页\总数一百五十七页\编于四点

由不同微生物分离得到的限制酶，如果识别位点和切割位点相同，则称同裂酶(isoschizomers)；如仅仅是黏性末端突出的单链相同，称为同尾酶(isoeaudarners)。由同尾酶切割的限制片段彼此相连，不能再被原来的限制酶切割。表13-1显示了部分限制性内切酶的识别序列。目前十六页\总数一百五十七页\编于四点表13-1限制性内切酶的识别序列(↓表示酶切位点) 酶识别序列Sau3AIBamHIEcoRIPstIHindIIISmaIINotI↓GATA/CTAG↓G↓GATCC/CCTAG↓GG↓AATTC/CTTAA↓GCTGCA↓G/G↓ACGTCA↓AGCTT/TTCGA↓ACCC↓GGG/GGG↓CCCGC↓GGCCGC/CGCCGG↓CG目前十七页\总数一百五十七页\编于四点(3)Ⅲ型限制修饰系统为两个亚基的双功能酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责切割。其修饰与切割均需ATP提供能量，切封位点在识别位点下游24～26bp处。目前十八页\总数一百五十七页\编于四点限制酶的生物学功能在于降解外来的DNA，自身DNA的酶切位点由于修饰酶的甲基化而受到保护。在基因工程操作中限制酶可作为切割DNA分子的手术刀，用以制作DNA限制酶谱，分离限制片段，进行DNA体外重组等，是十分有用的工具酶。目前十九页\总数一百五十七页\编于四点由于DNA的遗传连锁图谱仅能显示出遗传标记之间的相对距离，而Ⅱ型内切酶总是在特定序列或其附近切割，根据这个原理可以获得DNA的物理图谱，从而显示碱基对之间的实际距离。已绘制出的第一张DNA物理图谱是猿猴病毒40(SV40)的图谱。目前已经测绘出许多种细菌、病毒和低等真核生物DNA的物理图谱。—些高等真核生物，包括人的DNA图谱正在绘制之中。目前二十页\总数一百五十七页\编于四点目前二十一页\总数一百五十七页\编于四点目前二十二页\总数一百五十七页\编于四点目前二十三页\总数一百五十七页\编于四点酶切后产生限制性DNA片段的大小是物理图谱的基础。对特定的限制酶，切割位点之间距离越远，限制性片段就越长。通过凝胶电泳。可以将大小不同的片段分开，依据片段的迁移率与已知片段比较，可判定未知片断的大小。图13-3显示了一种对DNA片段上限制性酶切位点作图的方法。目前二十四页\总数一百五十七页\编于四点表13-2给出了3类限制性内切酶的酶切特性。特性I型II型III型限制和修饰活性蛋白亚基数必需条件

宿主特异性位点序列

切割位点

酶活性转换DNA转运甲基化位点功能不分开3ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)EcoB：TGANδTGCTEcoK：AACNδGTGC随机，距宿主持异性位点1000bp以上无有宿主持异性位点功能分开1Mg2+

旋转对称

在特异性位点上或其附近有无宿主特异性位点功能分开2ATP、Mg2+(SAM)EcoP1：AGACCEcoP15：CAGCAG距宿主特异性位点3′端24~36bp有无宿主特异性位点目前二十五页\总数一百五十七页\编于四点目前二十六页\总数一百五十七页\编于四点13.2.2核酸的限制酶切图谱与物理图谱目前二十七页\总数一百五十七页\编于四点1.DNA限制酶切图谱DNA的限制酶切图谱指DNA限制酶切的片段沿着染色体或染色体片段上的DNA链中依次排列的顺序。限制性内切DNA(restrictionendonudease)是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。目前二十八页\总数一百五十七页\编于四点限制内切核酸酶的生物学功能在于降解外来的DNA，自身DNA的酶切位点由于修饰酶的甲基化而受到保护。在基因工程操作中，限制酶作为切割DNA分子的重要工具用以绘制DNA限制酶谱，进行DNA体外重组等。它的发现为选择性切割基因提供了极为方便的工具，使DNA的重组技术成为可能。目前二十九页\总数一百五十七页\编于四点2.DNA物理图谱(physicalmap)DNA限制酶切图谱并不是DNA的物理图谱，物理图谱指的是有关构成基因组全部基因的排列和间距参数和信息，包括限制性酶切图谱、cDNA图谱、一定水平上排列的DNA克隆库等，其中如果包括了DNA的核苷酸序列，则是分辨率最高的物理图谱(参见有基因工程方面的专著)。目前三十页\总数一百五十七页\编于四点

虽然同一物种的遗传图谱基本相同，但个体的DNA序列还有细微的差别，即具有“多态性”。遗传学上的多态性指某个基因在不同物种中的表现型。基因的不同表现型反映出DNA序列的不同，限制性内切酶的识别位点也可能不同。对同一物种的不同个体而言，这种差异称为“限制性片段长度多态性”(RFLPs)。目前三十一页\总数一百五十七页\编于四点根据限制性酶切位点的物理图谱，可以区分同一物种的不同个体，这对判断DNA的来源很重要。例如：父母双方某基因上的限制性位点有所不同，从子代的DNA图谱可以推知其基因来自双亲中的哪一方，这对跟踪遗传病、标出致病的突变位点有重要意义。目前三十二页\总数一百五十七页\编于四点13.2.3DNA连接酶

DNA连接酶能将DNA分子共价连接，当目的DNA片段插入载体后，分别连接双链DNA分子中的一条链，所提供的5′一末端须携有磷酸基团。大肠菌连接酶需要NAD+提供能量，而来自T4噬菌体的酶需要ATP供能。连接酶可效地使在黏性末端退火碱基对处闭合断开的磷酸二酯键连接。目前三十三页\总数一百五十七页\编于四点目前三十四页\总数一百五十七页\编于四点互补黏性末端之间碱基配对促使连接反应容易进行。平末端之间连接反应效率很低，为提高平末端连接效率常采取以下措施：①提高T~DNA连接酶浓度；②提高DNA片段浓度；③降低ATP浓度，以增强连接酶与DNA的结合；④加入多胺化合物，如亚精胺(spern~dine)，降低DNA的静电排斥力；⑤加入大分子排阻物乙二醇(PEG)、强水化物三氯化六氨钴等。目前三十五页\总数一百五十七页\编于四点DNA片段两末端若为相容黏性末端或平末端，连接时可以发生分子间串联，或是分子自身环化。这两个过程以何者占优势取决于DNA片段的链长与浓度，链短浓度较低，有利于自身环化。反之，链长浓度较高，有利于分子间串联。目前三十六页\总数一百五十七页\编于四点在DNA的末端加上一段限制性内切酶的识别序列，随后用限制酶切出所需要的黏性末端，使DNA的平端连接得以转变成为较易进行的黏性末端连接。这种含限制酶识别序列的DNA片段称为接头，通常是一条回文结构的寡核苷酸，在溶液中自身配对成为双链片段。例如，EcoRI的接头为GGAATTCC；HindⅢ的接头为CCCAAGCTTGGG。目前三十七页\总数一百五十七页\编于四点限制酶的切割位点靠近DNA片段的末端时其活性将受到影响。不同限制酶所受影响不同，因此限制酶的接头通常要比识别序列长。含有不只一种限制酶的末端识别序列，称为多接头。如果合成两条互补的寡核苷酸链，使其配对后—端为平末端，另一端为黏性末端，或两端为不同的黏性末端，此片段称为衔接物(adaptor)。目前三十八页\总数一百五十七页\编于四点在需要连接的两个DNA片段末端加上互补的均聚核苷酸后，连接反应比较容易进行。末端核苷酸转移酶能催化DNA末端3′-OH上添加脱氧核苷酸。如果在—个DNA片段的末端添加寡聚dT，在另一片段末端添加寡聚dA；或者分别添加寡聚dC和寡聚dG，这样两个片段末端可以“粘合”。然后用DNA聚合酶(常用DNA聚合酶I的大片段Klenow酶)填补缺口，最后留下的缺刻被T4DNA连接酶连上，互补均聚核苷酸末端的连接可见图13-4。目前三十九页\总数一百五十七页\编于四点目前四十页\总数一百五十七页\编于四点13.2.4核酸的聚合酶在图13-1标出一类聚合酶，这类酶在前面的有关章节中已做了介绍，此处不在赘述。目前四十一页\总数一百五十七页\编于四点13.2.5其他工具酶

图13-1中还列出了其他的工具酶，如碱性磷酸酶是催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5′磷酸的反应；末端转移酶是一种特殊的DNA聚合酶，在二价陌离子存在下，催化dNTP加到DNA分子的3′。羟基端，为DNA片段末端加尾提供方便，但此酶强烈偏向于带3′突出端的DNA受体；T4噬菌体多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基转移到DNA或RNA的5′末端，使探针的标记成为可能。目前四十二页\总数一百五十七页\编于四点另外还有其他一些核酸酶，如Sl核酸酶可降解单链RNA或DNA，产生带5′一磷酸的单核苷酸或寡核苷酸，但双链DNA、双链RNA或DNA-RNA杂合体对此酶不敏感；以及Bal31、外切核酸酶Ⅱ等。目前四十三页\总数一百五十七页\编于四点将外源DNA片段带入宿主细胞并进行复制的运载工具称为克隆载体(vector)。克隆载体含有在受体细胞内复制的起点，是—个能自主复制的复制子。通常由质粒、病毒或一段染色体DNA改造而成，质粒是染色体外自主复制的遗传因子，多为共价闭环DNA分子。目前四十四页\总数一百五十七页\编于四点13.3分子克隆的载体与宿主系统作为克隆载体最基本的要求是：①具有自主复制的能力；②携带易于筛选的选择标记；③含有多种限制酶的单_识别序列，以供外源基因插入；④除保留必要序列外，载体应尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖；⑤使用安全。目前四十五页\总数一百五十七页\编于四点构建载体时，通常需选择适当质粒、病毒或染色体复制子作为基础序列，删除其中非必需序列，然后插入或融合选择标记序列。最常用的选择标记是对抗生素的抗性基因，如抗氨苄青霉素(ampr)等。利用营养缺陷型宿主可以将相应生物合成基因作为标记，带有合成基因的载体可使宿主细胞在基础培养基中生长，无需补充原来所缺的营养成分。目前四十六页\总数一百五十七页\编于四点在构建载体时保留一些限制酶的切点作为外源DNA插入位点。现在常用一段合成的多接头插入载体，其上十分紧凑地排列着多种限制酶的单—识别序列，因此在用限制酶切时不会将载体切成碎片。对于载体上不合适的序列则需要用定位诱变的方法予以改造。目前四十七页\总数一百五十七页\编于四点13.3.1质粒载体基因工程的兴起，使克隆载体的发展与研制十分迅速，大致可分为三个阶段：第一个阶段主要依赖天然存在的质粒，如1973年Cohen等最早使用的载体pSCl01。其后对载体做了许多改造，包括删除非必需序列，引入标志基因，减少酶切位点等，通过删除、融合、转座及重排等操作，构建适合于多种用途的克隆载体目前四十八页\总数一百五十七页\编于四点如pBR322。它全长4361bp，含两个抗性基因(tetr和ampr)，具有天然质粒pMB的复制起点(ari)。pSCl01的复制受严紧型控制(stringentcontr01)，每个细胞只有1～2个拷贝；而pBR322为松弛型控制(relaxedcontrol)，每个细胞含25个拷贝以上(图13-5)。目前四十九页\总数一百五十七页\编于四点目前五十页\总数一百五十七页\编于四点目前五十一页\总数一百五十七页\编于四点pUC系列的质粒载体集中了当时载体的诸多优点。包括4个部分：①来自pBR322的复制起点(ori)；②氨苄青霉素抗性基因(ampr)；③大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因(laci)、启动子(Plac)和β半乳糖苷酶的α-肽(lacZ′)；④位于lacZ′基因中靠近5′端的一段多接头，或称为多克隆位点(MCS)。目前五十二页\总数一百五十七页\编于四点当宿主细胞的β-半乳糖苷酶基因发生删除突变(AMl5)，缺失N端的—段氨基酸序列，使酶失活，但在α-肽存在时可以互补使酶恢复活性。携带pUc质粒载体的大肠杆菌细胞在异丙基硫代母-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)的诱导下发生α-互补，可使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4一chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，X-gal被分解产生蓝色。目前五十三页\总数一百五十七页\编于四点多接头上十分紧凑地排列着多种限制酶的单—识别序列，外源基因在此插入后使α-肽失活，因此携带空载体的大肠杆菌呈蓝色菌落，携带外源基因的菌落呈白色菌落。此方法能够十分方便地鉴别重组克隆。目前五十四页\总数一百五十七页\编于四点

第三个阶段主要是借助一些辅助序列引入新的功能，如在puc18/19质粒载体中插入丝状噬菌体M13的基因间隔区，其含有单链复制起点，在M13辅助噬菌体帮助下可以产生单链DNA模板，该载体称为pUC118/119(图13-6)。目前五十五页\总数一百五十七页\编于四点目前五十六页\总数一百五十七页\编于四点质粒载体用途很广，借助插入各种特殊序列而适用于不同目的。当一个质粒含有噬菌体的复制起点时，称为噬菌质粒(phagemid)，可按噬菌体的方式复制和装配。上述的DUCll8/119即为噬菌质粒。若一个质粒含有两种宿主细胞中复制的起点，可在两种细胞中复制和存在，则称为穿梭质粒(shuttleplasmid)。目前五十七页\总数一百五十七页\编于四点真核生物的克隆载体，为了便于操作常使其先在大肠杆菌中扩增，将目的基因与其构成合适的重组体后才转入真核细胞，因此一般构成穿梭载体。如果插入能控制外源基因在宿主细胞内表达的序列，则称为表达载体(expressionvector)。目前五十八页\总数一百五十七页\编于四点13.3.2λ噬菌体(λphage)一般质粒载体约可携带外源DNA数千碱基，但如欲构建基因文库(genomiclibrary)，需要载体的容量更大些，常用入噬菌体改造而成的载体。λ噬菌体是大肠杆菌中的一种温和噬菌体，基因组为双链DNA，大小在50kb左右。DNA两端有黏性末端，由12nt组成。一旦进入宿主细胞后，λDNA两端的黏性末端配对结合形成环状。目前五十九页\总数一百五十七页\编于四点λDNA通过两条不同的途径增殖。裂解途径(lyticpathway)。溶源途径(1ysogenicpathway)。目前六十页\总数一百五十七页\编于四点在整个λ噬菌体基因组中，约有1/3的DNA序列对于噬菌体的复制和装配并非必需，因此可以用外源DNA取代这一部分DNA。此时，λ噬菌体携带外源DNA一起增殖，起到了载体的作用。已经设计出许多可用于DNA重组技术的λ噬菌体载体，其中用得较多的是Charon和λgt系列。目前六十一页\总数一百五十七页\编于四点λ噬菌体载体分为插入型(insertion)和置换型(substitution)两种，前者将线性载体用单个限制酶切开后即可将外源基因相容限制片段与载体两臂连接；后者需切除载体的一个片段，再将外源基因与之替换。无论是前者还是后者，携带外源基因后重组体DNA总长度应为λ噬菌体DNA的78%～105%，病毒外壳蛋白才能将其装配成病毒颗粒。目前六十二页\总数一百五十七页\编于四点用入噬菌体DNA作载体进行DNA克隆的另一个优点是易于使细胞感染，提高了使外源DNA导入细胞的效率，这对于建立基因文库十分重要。图13-7为以入噬菌体载体克隆DNA的图解。目前六十三页\总数一百五十七页\编于四点目前六十四页\总数一百五十七页\编于四点λ噬菌体外壳蛋白在包装噬菌体颗粒时，需先形成囊状头部前体。λDNA经滚环复制使单位长度基因组(单体)串联成一条长链，称为多联体(concate-mer)，彼此以COS位点相连接。噬菌体编码的A蛋白结合在cos位点上，并将λDNA带到头部前体的入口处，DNA填满头部，A蛋白在cos位点处交错切开λDNA，产生黏性末端。随后分别装配的针筒状尾部与头部结构连成一体，最终成为成熟的λ噬菌体颗粒。目前六十五页\总数一百五十七页\编于四点13.3.3柯斯质粒(cosmid)含有cos位点的质粒称为柯斯质粒，这种质粒可以携带大至35~48kb的外源DNA，而入噬菌体载体最多只能携带23kb的外源DNA。目前六十六页\总数一百五十七页\编于四点cosmid主要用于构建基因组文库，以获得基因组大片段DNA的克隆。cosmid与外源DNA的重组体只要两个COS位点间的长度合适，即可装配成入噬菌体颗粒，但其中的DNA却并非XDNA。该噬菌体颗粒仍可感染大肠杆菌，进入宿主细胞内的重组cosmid质粒携带了外源DNA，而不含入噬菌体基因。图13-8为柯斯质料克隆基因组DNA的示意图。目前六十七页\总数一百五十七页\编于四点目前六十八页\总数一百五十七页\编于四点13.3.4M13大肠杆菌丝状噬菌体包括亲缘关系十分相近的M13、fl和fd，它们都含有长度为6.4kb的单链环状DNA，基因组共编码10种蛋白质或小肽，复制起点和装配起始信号均位于基因间隔区(IG)。丝状噬菌体经F菌毛(pilus)感染大肠杆菌。噬菌体DNA的复制需先将单链DNA(ssDNA)转变成双链复制形式DNA(RFDNA)。目前六十九页\总数一百五十七页\编于四点构建M13载体(M13mp系列)是在M13复制型的IG区插入乳糖操纵子(lac)的一个片段，其中包含lacIq(lacI的突变体，可产生超量阻遏蛋白)、lac启动子以及带有多接头的lacZ′(β-半乳糖苷酶的α-肽)，使M13载体转染宿主细胞后，在IPTG和X-gal存在下由于α-互补作用产生蓝色噬菌斑；但若载体插入外源DNA，不形成α-互补，只产生白色噬菌斑，为重组噬菌体筛选提供了方便的标志。目前七十页\总数一百五十七页\编于四点

丝状噬菌体复制型双链DNA先经过几轮Ө型复制，再通过滚环复制产生单链正链DNA，正链DNA环化后装配成噬菌体颗粒。外壳蛋白在合成后即转移到质膜上，装配发生在噬菌体单链DNA复合物穿膜过程中。目前七十一页\总数一百五十七页\编于四点近年来噬菌体展示技术得到迅速发展，该技术是将外源基因通过接头与噬菌体外壳蛋白基因相融合，从而使外源蛋白能够在噬菌体表面展示，借此可以研究蛋白质分子的相互识别与作用，或从展示库中选择特定功能的蛋白质。噬菌体展示主要用噬菌体M13作为载体。表13-3给出了各类载体的主要功能。目前七十二页\总数一百五十七页\编于四点表13-3各类载体的主要功能和单链探针、定位诱变、噬菌体展示 实例PBR322、pUC系列BluescriptM13凯伦、λgt系列PJC、pWE系列M13mp系列克隆DNA片段大小装配成噬菌体颗粒＜10kb不能＜23kb能＜49kb能＜300~400bp能

质粒λ噬菌体柯斯质料单链噬菌体用途外源基因的克隆和表达、以及各种基因操作和分析建基因文库和cDNA文库建基因文库制备单链模板和单链探针、定位诱变、噬菌体展示目前七十三页\总数一百五十七页\编于四点13.4DNA的克隆克隆，即单一亲代细胞通过无性繁殖而产生的一组细胞，这些细胞具有相同的基因型。因此从同一受精卵分裂而来的单卵双生子属于同一克隆。在生物学上，要克隆一个生物，就意味着从一个生物群体中的单一个体获得遗传同—性的—个生物群体。在分子生物学中，欲克隆一个DNA分子，就意味着从单一DNA分子获得一群遗传同一性的DNA分子，这样产生的DNA分子称克隆。目前七十四页\总数一百五十七页\编于四点任何DNA克隆的过程包括五个基本步骤：①获得目的DNA片段；②将目的片段连接到载体上；③将人工重组的DNA引导进入受体细胞；④检出目的转化子；⑤将目的转化子进行表达分析。图13-9显示在大肠杆菌中的DNA克隆策略。目前七十五页\总数一百五十七页\编于四点目前七十六页\总数一百五十七页\编于四点13.4.1目的DNA片段的获得—个生物的特定基因可以从构建的基因文库中筛选。如果基因的序列是已知的，可以用化学方法合成，或者用聚合酶链式反应(PCR)由模板扩增。最常用并且无需已知序列的方法是建立一个基因组文库(genomiclibrary)或eDNA文库(eDNAlibrary)，从中筛选出目的基因的克隆。目前七十七页\总数一百五十七页\编于四点13.4.2将目的片段连接到载体上

用限制酶将质粒DNA切开产生全长的线性DNA片段。再用同样的限制酶或兼容酶将外源DNA消化，产生与载体同样末端大小的DNA片段。克隆载体是环状质粒DNA或噬菌体DNA。目前七十八页\总数一百五十七页\编于四点

第二步是将消化的两种。DNA混合，并加入DNA连接酶。当载体的两个末端与一个外源片段的两个末端分别连接，形成重组体DNA后，外源片段即被克隆进入载体。这样形成的重组体DNA不管用什么方法引入合适的受体细胞，都能进行复制。重组体DNA复制后，受体细胞中必定含有外源片段的多个拷贝或多个克隆。目前七十九页\总数一百五十七页\编于四点两类DNA片段混合后有效连接的关键是载体的两个末端与DNA片段两个末端的有效碰撞。如果载体两个末端碰撞，则导致无效连接。因此在一个连接反应中，载体和片段的浓度以及末端比例对有效连接至关重要。目前八十页\总数一百五十七页\编于四点13.4.3重组DNA引导进入受体细胞1.外源基因导入原核细胞2.λ噬菌体的体外包装3.外源基因导入真核细胞

目前八十一页\总数一百五十七页\编于四点1.外源基因导入原核细胞

将外源DNA导入宿主细胞，以改变细胞遗传性状的过程称为转化(transformation)；将病毒DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞，称为转染(transfection)，以与病毒的感染(infection)相区别。目前八十二页\总数一百五十七页\编于四点在低温下Ca2+使质膜变脆，经瞬间加热产生裂隙，外源DNA得以进入细胞内。制备感受态细胞的方法有了不少改进，主要是加入各种金属离子或用还原剂和二甲亚砜处理细胞膜。采用脉冲高压电瞬间击穿双脂层细胞膜能使外源DNA高效导入细胞，该方法称为电穿孔法(eiectroporation)。电击转化的效率与两电极间的电位梯度有关，在相等电位梯度下，细胞越大，细胞两端的电位差也越大，因此细胞膜易被击穿。目前八十三页\总数一百五十七页\编于四点2、λ噬菌体的体外包装

λ噬茵体颗粒能将其DNA分子有效注入大肠杆菌细胞内，而与颗粒内所含DNA的来源无关。重组λ噬菌体载体DNA或柯斯载体DNA,只要片段大小合适，都能与λ噬菌体外壳蛋白和协助包装的蛋白一起在体外包装成噬菌体颗粒。目前八十四页\总数一百五十七页\编于四点为获得λ噬菌体的整套包装蛋白，以便与重组DNA在体外进行包装。有两种方法可以阻止包装蛋白与细胞内hDNA的包装。—是从两株各带有λ噬菌体缺陷溶源体的大肠杆菌中制备出一对互补的提取物。这两种提取物分别缺少一种关键的包装蛋白，它们单独存在时不会与内源kDNA发生包装，只在有重组DNA存在时将二者合并，才可包装。目前八十五页\总数一百五十七页\编于四点其二是溶源菌的λ溶源体，cos位点被去除。因此可用单一菌株的包装蛋白提取物，因其只能和外源重组DNA发生包装。目前八十六页\总数一百五十七页\编于四点3、外源基因导入真核细胞在基因工程研究过程中，经常需要将外源基因导入真核细胞，以对基因进行改造和表达。常用的基因工程真核细胞包括酵母细胞、动物细胞和植物细胞。酵母菌由于生长条件简单，已成为真核生物基因工程优选的宿主细胞。目前八十七页\总数一百五十七页\编于四点在对酵母细胞进行外源DNA的转化时，需先用酶将其细胞壁消化水解，变成原生质体。蜗牛消化酶具有纤维素酶、甘露聚糖酶、葡萄糖酸酶以及几丁质酶等，对酵母菌细胞壁有良好水解作用。原生质体在CaCl2和聚乙二醇存在下；重组DNA能容易地被宿主细胞吸收，将转化的原生质体悬浮在营养琼脂中，即可再生出新的细胞壁。目前八十八页\总数一百五十七页\编于四点外源基因导入动物细胞常用的方法有：①磷酸钙共沉淀法②DEAE-葡聚糖(DEAE-dextron)或聚阳离子(polycation)③脂质体法(liposome)④脂质转染法(1ipofecfin)⑤电穿孔法目前八十九页\总数一百五十七页\编于四点以当诸方法中，磷酸钙共沉淀法成本低、操作方便，但效率低；脂质转染法和电穿孔法，前仪器者需要昂贵的试剂，后者需要特殊的仪器，但因效率很高，目前较常用：对哺乳动物受精卵等较大的细胞，导入外源DNA可采用显微注射法，在显微镜下，用极细的玻璃注射器针头(0.1～0.5μm)插入细胞内并注入DNA溶液。该方法效率极高，还可直接将DNA送入核内，但需要昂贵的仪器，且技术复杂不易掌握。目前九十页\总数一百五十七页\编于四点原生质体经细胞培养后可以再生出细胞壁，显微注射法可直接将外源NA注入细胞内。而无需制备原生质体。目前九十一页\总数一百五十七页\编于四点根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒上(tumerinducinggplasmid)有一段T-DNA,又称转移DNA,能携带外源基因转移到植物细胞内，并整合到染色体DNA中。因此Ti质粒是目前植物基因工程中最常用的理想的基因载体。将外源基因插入Ti质粒载体的T-DNA内，借助根癌土壤杆菌而将外源基因导入植物细胞。目前九十二页\总数一百五十七页\编于四点根癌土壤杆菌能从植株伤口处侵入，吸附在细胞壁上，T-DNA随即进入植物细胞内，诱发植株形成冠瘿瘤．根癌土壤杆菌本身并不进入植物细胞。将带有重组Ti质粒的根癌土壤杆菌与刚再生了新细胞壁的原生质体共同培养，易于促使植物细胞发生转化。目前较常用的是叶盘转化法(1eafdisctransformation)图13-10显示了用Ti质粒为载体进行植物基因工程图解。目前九十三页\总数一百五十七页\编于四点目前九十四页\总数一百五十七页\编于四点利用动、植物病毒作为转移基因的载体，不仅能将外源基因导入培养的细胞，而且可以直接导入个体，通常效率都比较高。使用病毒载体最大的问题是安全性，在构建载体时通常需将病毒的毒性基因删除，并有效防止病毒基因组在细胞内发生重组，在生物个体水平上进行转基因的另一有效方法是高速微弹发射装置(high-vekitymicroprojectilesbambardment)，又称基因枪(genegun)目前九十五页\总数一百五十七页\编于四点13.5目的基因的获得目前，获得目的基因的途径主要有：①最常用且无需已知序列的方法是建立基因组文库(genornic1ibrary)或cDNA文库(cDNAlibrary)，从中筛选出目的基因的克隆；②如果基因的序列是已知的，则用化学方法或酶法合成，或通过设计引物，用聚合酶链式反应(PCR)由模板扩增获得；③通过鸟枪法或差异显示和RT-PCR等方法获得。下面简单介绍第一种途径。目前九十六页\总数一百五十七页\编于四点13.5.1基因组文库的构建利用重组体DNA技术将某种生物细胞的基因组DNA的所有片段随机连接到基因载体上，转入合适的宿主细胞中，通过细胞增殖而使外源片段扩增。当克隆数目多到足以把某种生物基因组的全部基因都包含在内时，这一组克隆的总体称为该生物的基因组文库。目前九十七页\总数一百五十七页\编于四点基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。理想情况下的基因文库应包含该基因组的全部遗传信息。目前九十八页\总数一百五十七页\编于四点基因文库的构建大致分为以下五个步骤：

(1)染色体DNA的片段化(2)载体DNA的制备(3)体外连接与包装(4)重组噬菌体感染大肠杆菌(5)基因文库的鉴定和扩增

目前九十九页\总数一百五十七页\编于四点基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装目前一百页\总数一百五十七页\编于四点目前一百零一页\总数一百五十七页\编于四点基因重组反转录酶mRNAcDNA13.5.2cDNA文库的构建目前一百零二页\总数一百五十七页\编于四点1、cDNA文库构建的原理

真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经反转录合成互补的DNA(complementaryDNA，cDNA)，并连接相应的原核细胞表达控制元件，才能在原核生物中表达。cDNA文库指细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总和。目前一百零三页\总数一百五十七页\编于四点2、mRNA的分离制备

构建cDNA文库的关键是制备高质量的mRNA。目前实验室中提取细胞总RNA的方法主要有：胍盐/氯化铯密度梯度超速离心法和酸性胍/酚/氯仿抽提法。目前一百零四页\总数一百五十七页\编于四点3、cDNA的合成

合成cDNA的反转录酶有两种，一种来自禽成髓细胞性白血病病毒(AMY)，另一种来自莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)。反转录酶为多功能酶，它能以4种dNTP为底物，以RNA链为模板合成第一条cDNA链，并具有RNaseH活性，水解杂合分子中的RNA链，再以第一条cDNA链为模板合成第二条dDNA链。目前一百零五页\总数一百五十七页\编于四点4、双链cDNA的克隆

用来克隆cDNA的载体主要为质粒和入噬菌体载体。克隆的常用方法有：①平端连接法；②cDNA两端加接头或衔接物；③均聚物加尾法；④将上述几步合并进行，例如用衔接物与引物合在一起，合成cDNA后即具有黏性末端，或者将引物加在载体DNA上，cDNA合成后直接连在载体上。

目前一百零六页\总数一百五十七页\编于四点5、构建cDNA文库的基本步骤

构建cDNA文库有五个基本步骤：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA；④双链cDNA的分子克隆；⑤鉴定构建的cDNA文库，测定文库所包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性。cDNA文库的构建如图13-12所示。目前一百零七页\总数一百五十七页\编于四点目前一百零八页\总数一百五十七页\编于四点13.6克隆基因的分离与鉴定

分离带有目的基因的重组体克隆，一般是按照重组体某些特征直接从库中挑选，称为选择(selection)，或是从基因库中筛选(screening)。无论是选择还是筛选，其依据或是载体的特征、或是目的基因的序列、或是基因的产物。目前一百零九页\总数一百五十七页\编于四点13.6.1以载体特征直接选择

根据载体的表型特征直接选择重组体克隆是十分有效的也是最常用的方法。将它与微生物学的技术配合使用，常能处理大量的微生物群体。常用的直接选择方法主要有：①抗药性选择；②营养标记选择；③β-半乳糖苷酶显色反应选择法。目前一百一十页\总数一百五十七页\编于四点13.6.2细菌菌落或噬菌斑的原位杂交

从众多重组体中分离目的基因克隆可用特异探针原位杂交(insituhybridization)。目前一百一十一页\总数一百五十七页\编于四点目前一百一十二页\总数一百五十七页\编于四点

杂交筛选法的关键是获得特异性探针。如果目的基因的序列已知或部分已知，探针可从已有的克隆中制备，或是设计一对引物从基因组序列中扩增，也可以用化学法合成。目前一百一十三页\总数一百五十七页\编于四点

但如果目的基因的序列未知，而有他种生物同一基因的序列是已知的，因同源基因间有较大的相同性，故可用同源基因的序列作为探针。若未知基因序列，但其蛋白质序列已知或部分已知，可以按密码子的简并性，合成简并探针。目前一百一十四页\总数一百五十七页\编于四点13.6.3差别杂交或扣除杂交法分离克隆基因

细胞在不同的发育、分化和生理状态下其基因的表达往往有差异，有些决定某种性状的特异基因只在特异的细胞中表达，利用差别杂交法(differentialhy-bridization)可以分离该特异的基因克隆。目前一百一十五页\总数一百五十七页\编于四点

由于差别杂交法十分费时，费力，灵敏度低，对低丰度cDNA克隆难以检测，于是研发出了扣除杂交(subtractivehybridization)法，用一般细胞的mRNA与特殊细胞的cDNA杂交，先扣除一般共有的eDNA，再将剩下特异的dDNA进行克隆，用此方法已成功克隆出控制动物胚胎发育和组织分化的基因。扣除杂交流程如图13-14所示。目前一百一十六页\总数一百五十七页\编于四点目前一百一十七页\总数一百五十七页\编于四点13.6.4从表达文库中分离克隆基因

真核与原核生物基因表达的调控机制却有很大的不同，真核生物的cNDA或编码序列必须接上原核生物基因调控元件，其中包括启动子、SD序列和终止子等，才能在原核细胞中表达。目前一百一十八页\总数一百五十七页\编于四点

从表达文库中通过表达产物来分离克隆的基因有以下常用方法：①免疫学方法；②检测产物的功能活性；③检测产物性质与结构，相对分子质量、肽谱等。目前一百一十九页\总数一百五十七页\编于四点13.6.5克隆基因的鉴定

无论用哪种方法分离克隆的基因，都要重复核实，以避免假阳性，然后进一步对基因进行鉴定。通常鉴定基因的方法主要有：①根据基因的结构和序列；②根据表型特征等；③根据基因产物的性质。目前一百二十页\总数一百五十七页\编于四点13.7聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是DNA的体外酶促扩增，故又称为无细胞的分子克隆法。目前一百二十一页\总数一百五十七页\编于四点13.7.1PCR反应的基本原理PCR方法模仿体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开；然后使引物与模板退火，二者碱基配对。DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA链以指数方式扩增。目前一百二十二页\总数一百五十七页\编于四点13.7.2PCR反应的基本步骤(1)设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列。(2)优化反应体系，以便获得最好的扩增效果。(3)选择3个循环温度，变性，94℃，45～60s；退火(根据引物与模板的Tm值确定，一般为两个引物中较低的Tm值减2)，lmin；延伸。72℃，1rain。开始时热变性5～10min，热循环25～30个周期，最后延伸10min。(4)扩增完成后取出一定量反应产物，检测扩增结果。最常用方法是凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外光下检测。目前一百二十三页\总数一百五十七页\编于四点目前一百二十四页\总数一百五十七页\编于四点13.7.3PCR技术的发展与应用

在所有生物技术中，PCR技术发展最迅速，应用最广泛，它对生物学、医学和相邻学科带来了巨大的影响。它发展的新技术和用途大约有以下几个方面：目前一百二十五页\总数一百五十七页\编于四点(1)PCR常用于合成特异探针通常PCR所加两端引物的摩尔数是相等的，若加入不等量的引物，例如60:1，即为不对称PCR(asymmetricPCR)，可用于合成单链探针或其他用途的单链模板。(2)用于DNA的测序PCR可用于制备测序用样品。(3)RT-PCR将反转录技术与PCR技术相偶联，可用于扩增被反转录成cDNA形式的特定RNA序列。RT-PCR主要用于：目前一百二十六页\总数一百五十七页\编于四点①分析基因转录产物，②构建cDNA库，③克隆特异cDNA，④合成eDNA探针，⑤构建RNA高效转录系统等。目前一百二十七页\总数一百五十七页\编于四点(4)产生和分析基因突变PCR技术十分容易用于基因定位诱变。利用寡核苷酸引物可在扩增DNA片段的末端引入附加序列，或造成碱基的取代，缺失和插入。目前一百二十八页\总数一百五十七页\编于四点(5)重组PCR将DNA不同序列连在一起。重组PCR在基因工程操作中十分有用，用酶切割和连接常常找不到合适的酶切位点，而且引入的多余序列无法删除。重组PCR只需设计3个引物：①左边DNA片段的5′引物；②连接两片段的引物；③右边片段的3′引物，经过数轮PCR即可将两片段连在一起。目前一百二十九页\总数一百五十七页\编于四点(6)未知序列的PCR扩增通常PCR必须知道欲扩增DNA片段两端的序列，才能设计一对引物用以扩增该片段。但在许多情况下需要扩增的片段序列是未知的，一些特殊的PCR技术可用来扩增未知序列，或从已知序列扩增出其上游或下游未知序列。反向PCR(inversfiPCR)通过使部分序列已知的限制片段自身环化连接，然后在已知序列部位设计一对反向的引物，经PCR而使未知序列得到扩增(图13-15A)。目前一百三十页\总数一百五十七页\编于四点目前一百三十一页\总数一百五十七页\编于四点

从染色体已知序列出发，通过重复进行反向PCR，逐步扩增出未知序列的技术，称为染色体步移(chromosomewalking)，为染色体DNA的研究提供了有用的手段。(图13-15B)。目前一百三十二页\总数一百五十七页\编于四点

此外还有一些PCR技术可以扩增未知序列。例如，锚定PCR(anchoredPCR)，用末端核苷酸转移酶在合成DNA链的3′端加上均聚物，再用此均聚物互补的寡聚核苷酸作为另一引物进行PCR。利用人类基因组DNA中分散分布的Alu序列，用一段已知序列和Alu序列作为一对引物，也可以扩增出未知序列.目前一百三十三页\总数一百五十七页\编于四点

(7)基因组序列的比较研究应用随机引物的PCR扩增，便能测定两个生物基因组之间的差异。这技术称为随机扩增多态DNA分析(randomamplifiedpolymorphicDNA,，RAPD)。如果用随机引物寻找生物细胞表达基因的差异，则称为mR_NA的差异显示(dfifferentialdisplay)。PCR技术在人类学、古生物学、进化论等的研究中也起了重要的作用。目前一百三十四页\总数一百五十七页\编于四点(8)在临床医学和法医学中的应用PCR技术已被广泛用于临床诊断。如对癌基因、遗传病等疑难病和恶性疾病的确诊，病原体的检测(某些恶性疾病用一般微生物学、生化和免疫学技术无法查出时)，确定亲属间的亲缘关系，胎儿的早期检查等。目前一百三十五页\总数一百五十七页\编于四点13.8DNA的化学合成

1956年，Khorana首次成功合成了二核苷酸。将核苷酸所有活性基团都用保护剂封闭，只留下需要反应的基团，用活化剂使反应基团激活，再用缩合剂使一个核苷酸的羟基与另一核苷酸磷酸基之间形成磷酸二酯键，定向聚合，这种DNA合成法称为磷酸二酯法。目前一百三十六页\总数一百五十七页\编于四点DNA自动化合成采用快速的亚磷酸三酯法。腺嘌呤、胞嘧啶碱基上的氨基用苯甲酰基保护，鸟嘌呤碱基的氨基用异丁酰基保护，5′-羟基用二甲氧三苯甲基(DMT)保护。目前一百三十七页\总数一百五十七页\编于四点13.9基因定位诱变

基因定位诱变是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重组等变异。目前常用的定位诱变方法主要有：在酶切位点处插入、删除和置换序列。采用寡核核苷酸指导的诱变(oligonucleotide-directedmutagenesis)和PCR诱变手段。目前一百三十八页\总数一百五十七页\编于四点13.9.1酶切诱变

利用基因的酶切位点，可在其切点处改造基因序列。先选择合适的限制酶将基因切开，然后插入或删除有关序列。如若基因内部在需要诱变的部位缺乏可被利用的限制酶酶切位点，就要先用寡核苷酸指导的诱变或PCR诱变引入酶切位点。有时不能确定插入或删除的最适序列，可以插入一组变异的序列或是进行系统的插入或删除，由此构建成突变体库，从中再挑选最理想的突变体。目前一百三十九页\总数一百五十七页\编于四点13.9.2寡核苷酸指导的诱变

Hutchison等用合成的寡核苷酸在体外诱导单链噬菌体~PXl74发生变异。用带有错配碱基的寡核苷酸与φX174的单链DNA退火，并以其作为引物用Klenow酶合成DNA，所产生局部异源双链的DNA转染细菌，结果使显示预期表