分析化学色谱联用分析法

分析化学色谱联用分析法第1页，共52页，2023年，2月20日，星期日色谱联用分析法

两种色谱联用（色谱-色谱）分析法

色谱与质谱、波谱联用的分析方法提高分离能力提高定性能力第2页，共52页，2023年，2月20日，星期日色谱-质谱、波谱联用分析法将分离能力很强的色谱仪与定性、定结构能力很强的质谱或光谱仪器通过适当的接口(interface)相结合成完整的分析仪器，借助计算机技术进行物质分析的方法。第3页，共52页，2023年，2月20日，星期日第一节色谱－质谱联用分析法

主要包括气相色谱－质谱联用GC-MS高效液相色谱－质谱联用HPLC-MS毛细管电泳－质谱联用CE-MS第4页，共52页，2023年，2月20日，星期日一、气相色谱－质谱联用

（一）原理

由于GC的试样呈气态，流动相也是气体，与质谱仪的进样要求相匹配，故最容易将这两种仪器联用。第5页，共52页，2023年，2月20日，星期日分离试样中各组分，起着样品制备的作用

气相色谱仪接口

起着气相色谱和质谱之间适配器的作用

质谱仪

气相色谱仪的检测器

计算机系统

获得色谱和质谱数据，进行数据采集和处理第6页，共52页，2023年，2月20日，星期日（二）气相色谱－质谱联用仪器

主要由色谱单元、质谱单元和接口三大部分组成接口装置的作用将色谱与质谱联接起来，以除去载气、降低气相色谱仪柱后流出物的气压，同时对试样起富集的作用，并把组分送到质谱仪的离子源。1．接口(interface)实现联用的关键

第7页，共52页，2023年，2月20日，星期日GC-MS对接口的一般要求是：①能使色谱分离后的各组分尽可能多地进入质谱仪，并使载气尽可能少地进入质谱系统。②维持离子源的高真空。③组分在通过接口时应不发生化学变化。④接口对试样的有效传递应具有良好的重现性。⑤接口的控制操作应简单、方便、可靠。⑥接口应尽可能的短,以使试样尽可能快速通过接口。第8页，共52页，2023年，2月20日，星期日GC-MS的接口有直接导入型和浓缩型

直接导入型

装置结构简单，容易维护，但它无浓缩作用喷射式浓缩型接口

具备去除载气、浓缩样品的功能，即具有分子分离的能力第9页，共52页，2023年，2月20日，星期日第10页，共52页，2023年，2月20日，星期日2．质谱单元

GC-MS中的质谱应满足下列要求：真空系统不受载气流量的影响灵敏度和分辨率与色谱系统匹配扫描速度与色谱流出速度相适应第11页，共52页，2023年，2月20日，星期日（1）离子源

电子轰击源（EI）是GC-MS中最常用的离子源

优点：①谱图重现性好

②有较多的碎片离子，提供丰富的结构信息③灵敏度高

化学电离源（CI）也是GC-MS配置的离子源之一第12页，共52页，2023年，2月20日，星期日（2）质量分析器四极质量分析器扫描速度快，并可从正离子到负离子检测自动切换，而且灵巧轻便，价格便宜，是GC-MS中最流行的质量分析器。离子阱质量分析器飞行时间质量分析器第13页，共52页，2023年，2月20日，星期日3．色谱单元用于GC-MS色谱系统应该符合质谱仪的一些特殊要求。主要是：①固定相应选择耐高温，不易流失的固定液，最好用键合相。②载气应不干扰质谱检测，一般常用氦气。第14页，共52页，2023年，2月20日，星期日（三）气相色谱－质谱分析的应用GC-MS联用分析的灵敏度高，适合于低分子化合物(相对分子质量＜1000）的分析，尤其适合于挥发性成分的分析。在药物的生产、质量控制和研究中在中药挥发性成分的鉴定食品和中药中农药残留量的测定体育竞赛中兴奋剂等违禁药品的检测环境监测第15页，共52页，2023年，2月20日，星期日二、高效液相色谱－质谱联用

（一）原理

以高效液相色谱为分离手段，以质谱为鉴定和测定手段，通过适当接口(interface)将二者联接成完整仪器。第16页，共52页，2023年，2月20日，星期日（二）高效液相色谱－质谱联用仪器1．高效液相色谱－质谱接口和离子化

接口装置必须既能满足液、质两谱在线联用的真空匹配要求，又能实现被分析组分的离子化。第17页，共52页，2023年，2月20日，星期日离子化方式有两种：试样在离子源中以气体形式被离子化是从固体表面或溶液中溅射出带电离子大气压离子化--最常用电喷雾离子化（ESI）大气压化学离子化(APCI)大气压光离子化(APPI)

第18页，共52页，2023年，2月20日，星期日（1）电喷雾离子化接口

电喷雾离子化是将溶液中试样离子转化为气态离子的一种接口带电液滴的形成溶剂蒸发和液滴碎裂离子蒸发形成气态离子第19页，共52页，2023年，2月20日，星期日电喷雾接口示意图

第20页，共52页，2023年，2月20日，星期日电喷雾离子化过程示意图第21页，共52页，2023年，2月20日，星期日HPLC-ESI-MS谱图主要给出准分子离子的相关信息，例如在单电荷情况下的[M+H]+、[M+Na]+、[M－H]等，对于生物大分子如蛋白质、肽等，还能产生大量的多电荷离子。ESI常用于强极性、热不稳定化合物及高分子化合物的测定。ESI的主要缺点是只能允许非常小的流动相流量。第22页，共52页，2023年，2月20日，星期日（2）大气压化学离子化接口

大气压化学离子化接口将溶液中组分的分子转化为气态离子的一种接口APCI适用分析有一定挥发性的中等极性与弱极性，相对分子质量在2000以下的小分子化合物。最大优点是使HPLC与MS有很高的匹配度,允许使用流速高及含水量高的流动相，极易与RP-HPLC条件匹配。与ESI相比，APCI对流动相种类、流速及添加物的依赖性较小。第23页，共52页，2023年，2月20日，星期日（2）质量分析器四极质量分析器离子阱质量分析器飞行时间质量分析器第24页，共52页，2023年，2月20日，星期日串联四极质量分析器--使用较广泛

将三个四极质量分析器串联起来使用

第一个四极质量分析器进行质量分离第二个四极质量分析器--碰撞池，产生产物离子产物离子由第三个四极质量分析器分离分析串联四极质量分析器能够进行选择反应监测，选择性更高，使用串联四极质量分析器的质谱称为串联质谱。

第25页，共52页，2023年，2月20日，星期日3．色谱单元HPLC-MS中的色谱柱一般短柱，以缩短分析时间，最常用的固定相为ODS。HPLC-MS对流动相的基本要求是不含非挥发性盐类，以防其析出堵塞毛细管等。所用溶剂的纯度最好都是色谱纯。流动相中挥发性电解质如甲酸、乙酸、氨水、乙酸铵等的浓度也不能太高。流动相的pH、流速均对检测灵敏度有很大影响。第26页，共52页，2023年，2月20日，星期日（三）高效液相色谱－质谱分析的特点和应用1．高效液相色谱-质谱联用的特点①适用的范围宽。②提供各种信息。可产生准分子离子和多级质谱可提供丰富的结构信息。③有很高的灵敏度和样品通量。可在色谱分离不完全的情况下对复杂基质中的痕量组分进行快速定性和定量分析。第27页，共52页，2023年，2月20日，星期日2．高效液相色谱-质谱联用的应用和分析条件

液相色谱－质谱联用技术在药学、临床医学、生物学、食品化工等许多领域的应用越来越广泛。

第28页，共52页，2023年，2月20日，星期日HPLC-MS分析实验条件的选择：（1）流动相和流量：常用流动相为水、甲醇、乙腈及它们的混合物，可用醋酸、甲酸或它们的铵盐溶液调节pH，应避免磷酸盐或离子对试剂等。流量对LC-MS分析有较大影响。（2）离子检测模式：碱性物质选择正离子检测模式，可用醋酸或甲酸使试样酸化至pKa－2。酸性物质及含有较多强电负性基团的物质，选择负离子检测模式。（3）温度：接口的干燥气体温度应高于待分析物沸点20℃左右，同时要考虑物质的热稳定性和流动相中有机溶剂的比例。第29页，共52页，2023年，2月20日，星期日三、毛细管电泳－质谱联用CE的高效分离能力与MS鉴定结构能力的有机结合第30页，共52页，2023年，2月20日，星期日若实现毛细管电泳-ESI-质谱联用，须解决的问题：①电压匹配问题。②CE是依赖电渗作为流体的动力，若与质谱联接时，质谱的高真空与CE造成的真空差，将会引起CE的电渗流的扰动，破坏分离。③CE的进样量小，要求MS要有很高的灵敏度。④CE分离工作大都是使用磷酸盐缓冲溶液来完成，与MS联用时，只能用易挥发盐的缓冲盐溶液。第31页，共52页，2023年，2月20日，星期日四、色谱－质谱的扫描模式及其提供的信息色谱-质谱联用分析扫描模式全扫描（fullscanning）选择离子监测(SIM)选择反应监测(SRM)第32页，共52页，2023年，2月20日，星期日（一）全扫描

全扫描是质量分析器在给定的时间范围内对给定质荷比范围进行无间断地扫描，获得样品中每一个组分（或在某一特定时刻）的全部质谱。在这种扫描模式下，可以获得各种定性和定量信息。第33页，共52页，2023年，2月20日，星期日1．色谱－质谱三维谱

X坐标表示质荷比m/z，Y坐标表示时间或连续扫描的次数，Z坐标表示离子流的强度(离子丰度)。

第34页，共52页，2023年，2月20日，星期日2.质谱将全扫描得到的分子离子或准分子离子（[M+H]+、[M－H]、[M+Na]+等）及所有碎片离子的质荷比与其对应的离子流的相对强度作图给出总离子流色谱图上每一个色谱峰的质谱第35页，共52页，2023年，2月20日，星期日

3.总离子流色谱图（TIC）是总离子流强度随时间（扫描次数）变化的色谱图

其中对应某一时间点的峰高是该时间点流进的组分的所有质荷比的离子强度的加和。给出保留值、峰高和峰面积第36页，共52页，2023年，2月20日，星期日4.质量色谱图是从计算机存储的总离子流色谱图的数据中，按质荷比调出的色谱图。

质量色谱可以鉴别某化合物或具有某基团的一组化合物的存在。

即使没有实现色谱完全分离的峰也可进行定量。第37页，共52页，2023年，2月20日，星期日第38页，共52页，2023年，2月20日，星期日（二）选择离子监测选择离子监测是对一个或一组特定离子进行检测的技术。只检测一个质量的离子称为单离子监测(SIM)检测多离子的称为多离子检测(MID)选择离子监测可以把全扫描模式所得的复杂的总离子色谱图变得非常简单，即获得的质量色谱图。提高了灵敏度，同时有更快的扫描速度。选择离子监测主要用于定量分析。第39页，共52页，2023年，2月20日，星期日（三）选择反应监测

选择反应监测是串联质谱的一种检测模式，即监测一个或几个特定的离子反应，监测几个离子反应又称为多反应监测(MRM)。

选择反应监测能对复杂混合物中的痕量组分进行快速鉴别和定量分析，选择性高，灵敏度高。此外，产物离子扫描、前体离子扫描和中性丢失扫描三种模式也是串联质谱的检测模式。第40页，共52页，2023年，2月20日，星期日第二节其他联用分析法一、气相色谱－傅立叶变换红外光谱联用（一）气相色谱－傅立叶变换红外光谱联用仪器由气相色谱仪、接口、傅立叶变换红外光谱仪及计算机系统四部分组成。第41页，共52页，2023年，2月20日，星期日在相应软件控制下，仪器进行实时傅立叶变换，在显示器上实时显示GC馏分的气态IR谱图

其x轴为波数，y轴为吸光度，z轴为时间（二）气相色谱－傅立叶变换红外光谱联用获得的谱图1.实时三维谱图

2.重建色谱图

在相应软件控制下，仪器进行实时傅立叶变换，在显示器上实时显示GC馏分的气态IR谱图，其x轴为波数，y轴为吸光度，z轴为时间由红外检测器记录的干涉图经计算机处理后得到的色谱图3．红外光谱图第42页，共52页，2023年，2月20日，星期日（1）化学图

（2）Gram-Schmidt重建色谱图

（3）红外总吸收度重建色谱图

重建色谱图包括：

第43页，共52页，2023年，2月20日，星期日二、高效液相色谱－核磁共振波谱联用核磁共振波谱是测定有机化合物结构的最强有力的技术之一但是实现这种联用又是最具有挑战性的一门技术

①HPLC流动相中的质子严重干扰组分的1H-NMR谱②梯度洗脱时，溶剂的浓度不断变化，δ值也不断变化③核磁共振波谱的灵敏度较低④NMR难于与HPLC在线联用第44页，共52页，2023年，2月20日，星期日HPLC-NMR能够获得复杂试样中微量组分的定性信息及二级结构信息，能测定这些组分的氢谱、碳谱及各种相关谱，必将成为复杂试样如中药的活性成分、生物样品中的药物及其代谢物等微量组分的定性分析和结构鉴定的最重要手段，目前已经出现了LC-NMR-MS联用技术用于代谢组学研究。第45页，共52页，2023年，2月20日，星期日色谱－色谱联用是由多种不同类型的色谱组合而成的联用系统，又称为多维色谱，其主要作用是提高色谱分辨能力和增加峰容量。

由同类流动相、相同分离机制但不同选择性色谱柱串联组成，例如GC-GC、HPLC-HPLC及SFC-SFC等。

由不同类流动相、不同分离机制及不同选择性色谱柱组成，例如HPLC-GC、HPLC-SFC、SFC-GC、HPLC-CE及GC-TLC、SFC-TLC、HP