蛋白质纯化色谱技术

蛋白质纯化色谱技术第1页/共93页一、色谱技术概述色谱法，层析法，色层法（Chromatography）是一种“分离＋检测”的“定量＋定性”分析方法1903－1906俄国科学家Tswett发明分类：色谱分离方法很多，种类有四、五十种

——按大类分类法：液相色谱（LiquidChromatography）气相色谱（GasChromatography）

——按原理分类法：

——按形式分类法：

——按工作压力分类法：

第2页/共93页色谱技术（分配色谱）概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（分离介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。第3页/共93页基本组成流动相泵分离柱检测器输液分离检测数据记录进样器进样色谱图第4页/共93页输液泵流速压力精度脉冲保养梯度形成第5页/共93页

进样位置废液样品流动相接色谱柱进样阀样品采样位置废液流动相接色谱柱手动（六通阀）进样器（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）定量环第6页/共93页层析柱（填料/介质）分离的关键场所使用方法不同，先查阅说明书注意清洗保养防止气泡进入样品及缓冲液的预处理保湿第7页/共93页填料（层析介质）蛋白质实验技术－层析纯化分离官能团；基质骨架；粒径/分辨率；第8页/共93页层析柱第9页/共93页监测器紫外监测器电导监测器pH值监测器保养与寿命

第10页/共93页收集器FractionCollectorFrac-950第11页/共93页RacktypesN.B.actualcolourswillbedifferent45x30mm4x96-wellplates(deepornormal)+8x30mm120x18mm+8x30mm(standardrack)240x12mm第12页/共93页操作系统第13页/共93页色谱系统第14页/共93页层析系统（蛋白纯化设备）AKTAprimeAKTApurifier第15页/共93页ExistingÄKTArangeÄKTAexplorer-fastmethoddevelopmentÄKTApurifier-highperformanceÄKTAFPLCÄKTAprime第16页/共93页IntroducingthenewÄKTApilot第17页/共93页18DownstreamsetupSTREAMLINE™200column,containing5LofSTREAMLINErProteinAinexpandedmode100Lscalefermentor第18页/共93页1997-06-1619ÄKTAmeansrealgenuinetrue第19页/共93页ÄKTAdesign-anevolvingplatform1996:ÄKTAexplorer-methodsandprocessdevelopment1997:ÄKTApurifier-peptideandnucleicacidpurification1998:ÄKTAFPLC-highperformanceproteinpurification1999:ÄKTAprime-simpleproteinpurification2000:Newfractioncollector,samplepumpandsoftware第20页/共93页1997-06-1621ÄKTAexplorerFastmethodandprocessdevelopmentandscale-upforproteins,peptidesandnucleicacidsFullyequippedfordevelopmenttasksOptions:AutosamplerSamplepumpAirsensors第21页/共93页1997-06-1622ÄKTApurifierHighperformancepurificationandcharacterisationofpeptidesandnucleicacidsOptions:AutosamplerSamplepumpValvesAirsensorsOptimisedforhighperformancepurification第22页/共93页1997-06-1623ÄKTAFPLCHighperformancepurificationofproteinsReliable,wellproventechnologyOptions:ValvesSamplePumpAirsensors第23页/共93页1997-06-1624ÄKTAprimeReliable,wellproventechnologyOptions:ValvesSamplePumpAirsensors第24页/共93页色谱操作一般过程装柱缓冲溶液平衡上样收集洗脱活性检测第25页/共93页色谱分离的基本概念分配系数可由Langmuir方程得出Kd分配系数q、c溶质在固相和液相中的浓度第26页/共93页分配系数蛋白质实验技术－层析纯化指一定温度下,处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。

K＝固定相溶质浓度/流动相溶质浓度分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。第27页/共93页

保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一第28页/共93页阻滞因子Rf阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小第29页/共93页理论塔板数蛋白质实验技术－层析纯化numberoftheoreticalplates色谱的柱效参数,用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。第30页/共93页色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：

N理论塔板数tR保留时间

W1/2半峰宽Wb峰底宽度理论塔板高度：L柱长第31页/共93页分辨率(Resolution)蛋白质实验技术－层析纯化分离度(Rs);表示两个洗脱位置相邻的溶质相互分离的程度。Rs=2(θR1－θR2)W1＋W2第32页/共93页相关视频Tricorn柱装填；XK柱装填；柱效检测。第33页/共93页

凝胶过滤色谱（GelFiltrationChromatography)也称大小（体积、空间）排阻色谱，是一种根据分子的大小和形状来进行分离的方法。不同的蛋白质分子通过凝胶微孔时因迁移能力不同而被分离。利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，（在其分离范围内）按分子大小将样品中各组份分离开来。大分子先被洗脱，小分子后被洗脱。二、凝胶过滤色谱第34页/共93页凝胶过滤色谱原理第35页/共93页第36页/共93页第37页/共93页分子量测定第38页/共93页脱盐第39页/共93页Sephadex系：是以氯代环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶。经典的凝胶介质Sepharose系:经过纯化的琼脂糖，含极少的带电集团。型号最多、应用最广Sephacryl系：有是丙基葡聚糖与N,N’-亚甲基双丙稀酰胺共聚而成。经济高效Superdex系：是葡聚糖与琼脂糖共聚而成的复合凝胶。最新，选择性强，分辨率极高常用的凝胶介质第40页/共93页脱盐：SephadexG10、25缓冲溶液交换：SephadexG10、25中间纯化：SephadexG200精纯：Sephacryl、Superdex常用的凝胶介质的应用第41页/共93页第42页/共93页型号分离范围Da粒径建议流速cm/hSepharose2B70-40,00060-20010Sepharose4B60-20,00045-16511.5Sepharose6B10-40,00045-16514SepharoseCL-2B70-40,00025-7515SepharoseCL-4B60-20,00025-7526SepharoseCL-6B10-40,00025-7530Sepharose65-5,00020-4030Sepharose121-30020-4030SepharoseFF610-4,000平均90300SepharoseFF460-20,000平均90250第43页/共93页建议流速20~39cm/h第44页/共93页建议流速30~60cm/h第45页/共93页色谱条件的选择凝胶介质：分离范围、分辨率。微粒越小，柱效越高，峰形越狭窄，分离度越高。流速：孔径较小较结实的填料，耐受的流速要高于孔径大的填料。上样：上样量；样品浓度<70mg/ml。压力监控。第46页/共93页三、离子交换色谱

IonExchangeChromatography，IEX

分离原理：根据蛋白质的带电类型（阳离子或阴离子），以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法第47页/共93页DEAE-Cl蛋白质－DEAE-Cl+DEAE-蛋白质NaCl蛋白质Cl阴离子交换色谱原理基质基质基质官能团二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）第48页/共93页原理蛋白质实验技术－层析纯化第49页/共93页分离谱蛋白质实验技术－层析纯化第50页/共93页色谱条件pH：阴离子交换层析：蛋白质带负电荷，则要求pH>pI，但不能高于介质功能基团的pK；阳离子交换层析：蛋白质带正电荷，则要求pH<pI，但不能低于介质功能基团的pK；第51页/共93页色谱条件缓冲溶液：阴离子交换层析：Tris-HCl阳离子交换层析：PB上样：盐浓度上样量：载量（吸附层析）样品蛋白浓度不可过高（低于10mg/mL）；须经离心或过滤处理第52页/共93页吸附速度：洗脱方式：改变离子强度、

pH层析聚焦（Chromatofacusing）等梯度洗脱阶段洗脱梯度洗脱洗脱速度：阶段洗脱可尽量大；梯度洗脱需根据出峰情况调整。第53页/共93页洗脱蛋白质实验技术－层析纯化线性洗脱梯度洗脱梯度洗脱第54页/共93页离子交换剂的选择考虑因素：酸碱强弱：由功能基团决定稳定性再生性经济第55页/共93页离子交换剂的选择工作PH2-92-126-112-122-122-12第56页/共93页常见类型纤维素类：无定形，分辨率和稳定性都较低葡聚糖系：体积和流速受PH值、离子强度影响较大；琼脂糖系：最常用聚乙烯醇系(Toyopearl)：全合成的苯乙烯系（Source）：流速快，分辨率高第57页/共93页常用的离子交换树脂葡聚糖凝胶型

DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纤维素系列离子交换剂

DEAE-SephacelCellex系列琼脂糖系列离子交换剂

Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交联琼脂糖离子交换剂第58页/共93页Source系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂S系列阴离子交换树脂Q系列MonoBeads系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列第59页/共93页MiniQPC3.2/3:GlutathionesynthetaseSDSStartingmaterialPeak2第60页/共93页第61页/共93页常见问题分析不吸附：缓冲溶液PH不对；离子强度太高；峰形不稳或出现奇异峰：柱床中有气泡或缓冲溶液不纯分辨率低：梯度太大；流速太高前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀第62页/共93页四、疏水性相互作用色谱

(HydrophobicInteractionChromatography）Hydrophobicinteractionchromatographyisaliquidchromatographytechniquethatseparatesbiomoleculesaccordingtotheirhydrophobicity＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－－－蛋白质表面电荷疏水区域分布示意图“盐促吸附层析”

在适当高盐浓度下，蛋白质的疏水残基与固定相上的疏水配基产生吸附作用。第63页/共93页第64页/共93页MechanismofHIC第65页/共93页A2800.04AUNa2SO41.0M疏水色谱操作第66页/共93页疏水色谱特点特点：它分离效率高，上样量大，特别适合分离盐析沉淀的样品。填料：烷基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶，丁基琼脂糖凝胶，辛基琼脂糖凝胶等。第67页/共93页疏水层析VS反相色谱同：分离介质（固定相）吸附原理异：作用强弱用途第68页/共93页五、反相色谱原理：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子迁移速度快而先被洗脱下来。一般使用甲醇、乙腈作流动相，使得蛋白质容易变性失活；常用于HPLC分析，与在水-有机相中稳定的多肽和低分子量蛋白质的分离。第69页/共93页反相液相色谱反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性第70页/共93页载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20μm）

HypersilSpherosilXOB075固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质

C18适于分离核酸苯基流动相的选择通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃第71页/共93页SourceRPC第72页/共93页30µm15µm5µmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffect第73页/共93页六、亲和色谱

（Affinitychromatography）载体活化、配基连接、吸附、洗脱第74页/共93页原理蛋白质实验技术－层析纯化第75页/共93页分离谱蛋白质实验技术－层析纯化第76页/共93页填料（层析介质）蛋白质实验技术－层析纯化骨架偶联配基第77页/共93页应用蛋白质实验技术－层析纯化抗体纯化；

IgG－蛋白A重组融合蛋白（His）6标签蛋白纯化－金属离子螯合剂

GST标签蛋白纯化－谷胱甘肽固相载体偶联配基；…第78页/共93页缓冲液蛋白质实验技术－层析纯化缓冲液A：缓冲液B：含竞争配体第79页/共93页亲和层析操作蛋白质实验技术－层析纯化第80页/共93页81ExpandedBedAdsorptionANewUnitOperation第81页/共93页82PrinciplesofoperationBeforestart-upsedimentedadsorbentEquilibration(expanded)SampleapplicationWashing(expanded)ElutionRegeneration(packedbed)第82页/共93页83Expansionvs.fluidizationExpandedbedNopressuredropoverthebedParticlesmovefreelyinsolutionNochannellingNegligibleback-mixingNoturbulenceFluidizedbedNopressuredropoverthebedParticlesmovefreelyinsolutionChannelling Extensiveback-mixingTurbulence第83页/共93页主要层析方法蛋白质实验技术－层析纯化原理上样A液B液富集专一GF分子筛分子量1％－5％低盐低盐－－IEX离子交换电离性载量低盐高盐＋－HIC疏水疏水作用载量高盐低盐＋－AC亲和配体结合载量－含竞争配体＋＋第84页/共93页第85页/共93页蛋白质实验技术－层析纯化第86页/共93页蛋白质纯化策略确定研究目标：要获得什么样的蛋白质？理化性质生物活性重点注意问题保证活性减少不必要的纯化步骤合理组织纯化步骤第87页/共93页技术捕获中间纯化精纯局限GF一般很好样品体积和流速受限IEX很好很好很好HIC良好很好一般蛋白质对剧烈的洗脱条件敏感