蛋白质的提取纯化和分析

蛋白质的提取纯化和分析第1页/共26页蛋白质的提取纯化和分析第2页/共26页材料选择和预处理细胞破碎蛋白质的粗提目录题目分析蛋白质的纯化分析检测第3页/共26页1题目解析已知某蛋白的分子量约为17kDa，等电点3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90°C加热3~4min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。在钙离子的作用下才能起到暴露疏水集团发挥性能，结合蛋白质基础知识从而可以判断其为钙调蛋白。第4页/共26页材料的选择TEXT材料的预处理成年健康雄性大鼠脑组织20克（比雌鼠体积大，成本较低物种易获得）将切取的组织用4℃预冷0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲液）第5页/共26页

预处理过的组织

细胞破碎（高速珠磨法）

制备组织细胞悬液（剪碎法）

蛋白质被释放出来331122破碎第6页/共26页剪碎法1.将组织块放入平皿后，加入少量PBS；2.用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10mlPBS；3.用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；返回第7页/共26页高速珠磨法破碎机理：高速珠磨法是一种有效的细胞破碎方法，珠磨机是该法所用的设备，其结构示意图见图（1）。微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞促进细胞膜破裂，释出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。第8页/共26页钙调蛋白的粗提取抽提蛋白质破碎后，使用适当的溶剂，将蛋白质提取溶解到溶剂当中，常用稀酸、稀碱、有机溶剂等电点3.9~4.1酸性蛋白质稀碱性溶液抽提溶液碱性的程度，碱性过大则难以复性pH调至等电点偏碱的一侧（4.1）第9页/共26页粗提取物离心操作除去固体杂质的上清液第10页/共26页热变性初步纯化天然结构%钙调蛋白一般蛋白100℃热稳定性不同第11页/共26页其他方法盐析法等电点法有机溶剂法第12页/共26页3蛋白质的精纯和分析鉴定第13页/共26页亲和色谱配体蛋白质蛋白质和配体复合物交联试剂载体配体载体与配体交联体杂质杂质游离配体洗脱结合耦联作用机理第14页/共26页金属螯合亲和层析钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个Ca2+结构域,每个结构域可以结合一Ca2+,这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+,钙调蛋白与Ca2+结合后的构型相当稳定。第15页/共26页金属螯合色谱原理：利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基

与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相

上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱

氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合

作用而进行分离NH2NH2NiHisHisHisHisprotein第16页/共26页步骤1.制作金属螯合亲和色谱柱：用浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液上柱。将上清液PH调制6-8，加入蛋白质解离抑制剂。慢上样3.再用配体CaCl2溶液洗脱，下方流出为目的蛋白液，用大使管或者烧杯盛装之。2.上柱后依次用50mlbufferB、200ml含0.5mol/LNaCl的bufferB洗脱。下方用大试管或烧杯收集杂质液。第17页/共26页配体蛋白质蛋白质和配体复合物第18页/共26页步骤目的：除去蛋白液中配体离子方法一：半透膜进行透析方法二：将上次获得目的蛋白液经凝胶过滤色谱柱下方首次接受的溶液即为高纯度的钙调蛋白溶液；第二次接受到的即为配体离子的溶液。第19页/共26页凝胶过滤色谱的洗脱第20页/共26页定性分析分析鉴定定量分析第21页/共26页定性分析

分子量凝胶电泳质谱(可同时鉴定分子量和纯度)活性根据蛋白质的功能选用不同的活性检测方法如：磷酸二酯酶(PDE)法常用方法SDS测定蛋白质的分子量和纯度MALDI-TOF-MS测定蛋白质的分子量和纯度第22页/共26页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定

蛋白质分子量

用SDS-PAGE检测不同纯化阶段所获得的提取液样品中CaM的纯度与相对分子质量。电泳采用质量分数为15%的分离胶和质量分数为5%的浓缩胶，120V电压条件下进行电泳，直至溴酚蓝达到凝胶底部，考马斯亮蓝染色，凝胶成像仪成像。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。第23页/共26页定量分析紫外检测法简单快速不破坏样品准确度低考马斯亮蓝染色法简单迅速干扰少灵敏度高(1μg)Folin-酚试剂法灵敏度高常用第24页/共26页