蛋白质及氨基酸测定

蛋白质及氨基酸测定第1页/共34页

蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等。蛋白质基本组成单位是氨基酸。一概述1蛋白质的构成第2页/共34页蛋白质是生命的物质基础，蛋白质占人体重量的16.3%，人体11%-13%总热量来自蛋白质。蛋白质是食品重要的营养成分，是最重要的质量指标，是食品良好色、香、味及品质的保障。2蛋白质的作用第3页/共34页3食物中蛋白质的含量食物名称蛋白质含量食物名称蛋白质含量猪肉9.5%苹果0.4%牛肉20.0%柑橘0.9%带鱼18.0%菠菜2.4%大豆40%黄瓜1.0%第4页/共34页4蛋白质换算系数

不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值6.25称为蛋白质系数。

不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、肉、蛋为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。第5页/共34页蛋白质的测定方法分两大类：

一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；

另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法：凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。双缩脲法、染料结合法、酚试剂法国外：红外分析仪5蛋白质测定方法第6页/共34页

在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。

食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量。第7页/共34页由Kieldhl于1833年提出，凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故至今仍被作为标准检验方法。由于食品中pro含量不同,分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，它们的基本原理都是一样的。二蛋白质的测定方法(一)凯氏定氮法第8页/共34页

样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。原理1常量凯氏定氮法第9页/共34页①消化总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4

＝

（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2OH2SO4

脱水性氧化性测定过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定第10页/共34页<1>加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。

<2>加硫酸铜作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。第11页/共34页②蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：

③吸收与滴定：氨气用硼酸溶液吸收，完全后，用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方程式如下：2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3＋Na2SO4＋2H2O2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3酒红色→蓝绿色

蓝绿色→微红色

第12页/共34页具体操作第13页/共34页第14页/共34页①

样品消化：准确称取均匀的固体样品0.5～3g，或半固体样品2～5g,或吸取溶液样品15～25ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，瓶颈45°角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色，继续加热0.5h，冷却至室温。具体操作第15页/共34页第16页/共34页

②

样品蒸馏：按图装好蒸馏装置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml40g∕L硼酸溶液及混合指示剂5~6滴）。凯氏烧瓶内，加入200ml蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入70ml400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。第17页/共34页③

滴定：将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点，蓝色变为灰红色。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。第18页/共34页式中:W—蛋白质的质量分数，%；

c—盐酸标准液的浓度，mol/L；

V1—空白滴定消耗标准液量，mL；

V2—试剂滴定消耗标准液量，mL；

m—样品质量，g；

0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol；

F—蛋白质系数。

结果计算第19页/共34页说明：①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。③消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。第20页/共34页④样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作为消泡剂，并同时注意控制热源强度。⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢2—3m1后再继续加热消化。第21页/共34页⑧蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸。⑦蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。

氢氧化铜在70～90℃时发黑。⑥一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。第22页/共34页2微量凯氏定氮法消化蒸馏样品消化后转移至100ml容量瓶中定容。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。准确吸取消化液10mL于反应管内，经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏5min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min。第23页/共34页第24页/共34页3自动凯氏定氮法第25页/共34页3自动凯氏定氮法特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：几分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。第26页/共34页

传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，又环境污染。新开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法等。(二)其它方法第27页/共34页脲（尿素）NH2—CO—NH2

加热至150-160℃时，两分子缩合成双缩脲。NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2原理1双缩脲法双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，这种反应叫双缩脲反应。第28页/共34页方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。

操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。蛋白质分子中含有肽键—CO—NH—与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）第29页/共34页│R（—NH—CH—CO）对紫外光有吸收作用在280nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。2紫外吸收法利用蛋白质的特有基团:原理第30页/共34页甲醛滴定法

1.原理：氨基酸本身有碱性—NH2—

基，又有酸性—COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与—NH2—

结合，碱性消失，再用强碱来滴定—COOH基。2．特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）三氨基酸的测定方法第31页/共34页3．双指示剂：①20%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将20%甲醛中和至蓝色。②0.0500mol/L氢氧化钠标准溶液。4．操作：移取含氨基酸样液约20mg，用水定容至100mL，取20mL于烧杯中，加60mL蒸馏水，用NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，加10mL中性甲醛溶液，继续滴定至pH9.2为终点