亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座

亲和层析法纯化胰蛋白酶

第一部分试验内容介绍亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第1页

1内容摘要亲和层析包含了一整套复杂底物及其配体与生物大分子之间相互作用时所形成独特生物学特征。在亲和结合过程中包括到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等原因影响。亲和层析概念能够了解为配基以共价键形式与水不溶性固体载体共价结合，形成含有高度专一性亲和吸附剂。以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂混合物中有针对性分离某一个成份。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第2页本试验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目标，从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高胰蛋白酶。围绕亲和层析试验所包括蛋白质和酶基本性质及相关技术进行综合训练。其中主要包含亲和层析介质配基制备，亲和介质合成，蛋白质和酶分离纯化，酶活性测定等内容。经过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备基本原理和操作，学习怎样进行试验设计，掌握试验过程中关键步骤，对试验中出现问题进行科学分析。使学生在学习试验技术同时，自觉培养分析问题和处理问题能力。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第3页2试验目标方法掌握蛋白质分离纯化基本原理与操作技术掌握亲和层析基本原理及亲和介质合成技术掌握胰蛋白酶活性及抑制活性测定原理和方法掌握消光系数法测定蛋白质原理及计算方法亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第4页1.

3试验流程

鸡蛋清

Spharose4B

猪胰脏

↓↓↓提取↓活化

提取分离纯化↓↓↓

纯卵粘蛋白(CHOM)→←活化Spharose4B

胰蛋白酶原粗提液↓↓

偶联

激活↓↓

CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液↓

亲和层析↓

酶促动力学

←

纯胰蛋白酶→酶活性测定

↓

酶蛋白含量测定亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第5页1.

4要求掌握技术柱层析技术SephadexG-25分子筛层析

DEAE-Cellulose离子交换层析CHOM–Sepharose4B亲和层析蛋白质提取技术

10%TCA提取鸡卵粘蛋白

3.5%乙酸,pH3.0提取胰蛋白酶原

蛋白含量测定技术消光系数法测定胰蛋白酶含量消光系数法测定鸡卵粘蛋白含量亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第6页生物活性测定

胰蛋白酶比活性测定鸡卵粘蛋白抑制活性测定

亲和介质合成技术载体-Sepharose4B前处理载体-Sepharose4B活化活化载体-Sepharose4B偶联亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第7页第二部分试验方法

试验一鸡卵粘蛋白分离纯化

1鸡卵粘蛋白基本性质1.1鸡卵粘蛋白组成分子量:28000Da分子组成:四个分子量相近亚基组成糖蛋白糖基部分:D-甘露糖,D-半乳糖,葡萄糖胺,唾液酸亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第8页1.2化学稳定性耐热:在80℃条件下,理化性质不发生改变耐有机溶剂:在50%丙酮溶液中,能保持良好溶解度耐沉淀剂:在10%TCA溶液中不发生沉淀.1.3等电点性质等电点:pI在3.9-4.5之间溶液中状态:在pH3.0溶液中稳定,在pH8.0溶液中轻易分解鸡卵粘蛋白在10%TCA不一样pH值溶液中溶解状态见表1。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第9页表1，鸡卵粘蛋白在10%TCA溶液中溶解度

溶液pH值鸡卵粘蛋白

鸡卵清蛋白

等于3.5沉淀5%溶解95%沉淀95%溶解5%低于3.5沉淀↑溶解↓沉淀↑溶解↓高于3.5沉淀↓溶解↑沉淀↓溶解↑

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第10页1.2.鸡卵粘蛋白提取2.1提取：

每组发给50毫升鸡卵清加入一定体积10%pH1.15TCA溶液(轻轻搅拌一边搅拌一边加入),搅匀后用pH试纸检验pH值,待pH稳定在3.5±0.2后放置4℃冰箱过夜.2.2离心：转移50毫升离心杯中,于3000rpm离心15min。2.3过滤：倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物2.4调pH值：用1mol/LHCl将溶液准确调至pH3.5。量取体积。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第11页2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。2.6离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000rpm离心15min。2.7除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀离心杯至于真空干燥器中。抽去残留丙酮。（沉淀物颜色由白变成透明胶状物即可）2.8溶解：加入25ml蒸馏水或20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液溶解，滤纸过滤，搜集滤液，备用。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第12页3鸡卵粘蛋白分离纯化3.1SephadexG-25柱脱盐(1)溶胀：称取15gSephadexG-25放入500ml烧杯中,加入200ml蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。(2)装柱：取一支30×3cm层析柱，将溶胀好SephadexG-25装柱，自然沉降。(3)处理：用2倍柱床体积0.5mol/LNaCl溶液洗柱，2倍体积蒸馏水洗去残留NaCl。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第13页

(4)平衡：用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0-1.5ml/min。紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定基线。(5)上样：将柱内缓冲液液面流至于胶面相切，取20ml鸡卵粘蛋白提取液上样，待样液液面流至于胶面相切，加入2-3ml缓冲液冲洗层析柱内壁，待溶液液面流至于胶面相切，然后加入缓冲液距胶面高度约2-3cm，以一样流速洗脱。(6)搜集：在检测仪上观察到开始出现峰时进行搜集。见图1亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第14页图1SephadexG-25分子筛层析分离图谱亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第15页3.2Cellulose离子交换柱层析分离(1)溶胀：称取20gDEAE-Cellulose放入500ml烧杯中,加入150ml蒸馏水，在室温下溶胀24小时。(2)装柱：取一支20×3cm层析柱，将溶胀好DEAE-Cellulose装柱，自然沉降。(3)再生：用200ml0.5mol/LNaCl–0.5mol/LNaOH混合溶液洗柱，再用蒸馏水洗至流出液pH值到达pH8.0。用200ml0.5mol/LHCl溶液洗柱，再用蒸馏水洗至流出液pH值到达pH6.0。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第16页(4)平衡：

用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0ml/min。紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定基线。(5)上样：

将经SephadexG-25柱脱盐卵粘蛋白溶液上样，用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，直到仪器绘出稳定基线。流速控制在1.0ml/min左右。(6)洗脱：

用0.3mol/LNaCl-20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液。(7)搜集：

在检测仪上观察到出现高峰时开始搜集。见图2亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第17页图2，鸡卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱分离亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第18页3.3透析及丙酮沉淀(1)透析：将经DEAE-Cellulose柱分离鸡卵粘蛋白转入透析袋内，对蒸馏水透析，隔一段时间换一次水，直到渗出液经BaCl2溶液检验无氯离子存在，即可。(2)调pH值：将透析好鸡卵粘蛋白溶液，用0.1mol/LHCl准确调至pH4.0（最好一次调成功），量体积。(3)丙酮沉淀：加入3倍体积预冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，在冰箱内静止4小时以上或过夜。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第19页(4)离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000rpm离心15min，搜集沉淀。(5)干燥：将盛有鸡卵粘蛋白离心杯放入真空干燥器中干燥。(6)搜集鸡卵粘蛋白成品，冰箱保留。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第20页4活性测定(1)标准胰蛋白酶活性测定空白:1.5ml缓冲液→1.5ml底物混匀.样品:1.5ml缓冲液→1.5ml底物→胰蛋白酶10μl混匀,马上测定(2)自提鸡卵粘蛋白抑制活性测定空白:1.5ml缓冲液→1.5ml底物混匀.样品:1.5ml缓冲液→鸡卵粘蛋白10μl→胰蛋白酶10μl混匀放置2min以上→1.5ml底物,马上测定亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第21页(3)鸡卵粘蛋白含量测定取透析液0.3ml稀释10倍,测定A280.3试验结果(1)计算鸡卵粘蛋白收率(2)计算标准胰蛋白酶比活性(3)计算鸡卵粘蛋白抑制活性。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第22页5试剂配制5.1公用试剂(1)10%TCA溶液,pH1.15,1500ml(50ml/组)(2)0.05mol/L,pH8.0Tris-HCl缓冲液,(内含0.2%CaCl2)200ml(3)2mmol/LBAEE底物溶液200ml(4)1mg/LTrypsin标准溶液10ml

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第23页5.2自配试剂(1)0.2mol,pH6.6,PBS缓冲液120ml(×10)(2)0.3mol/LNaCl–0.02mol/L,pH6.6,PBS缓冲液100ml(3)0.5mol/LHCl溶液200ml(4)0.5mol/LNaCl–0.5mol/LNaOH溶液200ml(5)0.5mol/LNaCl溶液250ml亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第24页6时间安排

星期早晨（8：00-12：00）下午（12：00-6：00）晚上一讲试验，配试剂提取鸡卵粘蛋白，装DEAE和G25柱，处理各柱

二离心，丙酮沉淀，平衡G25柱和DEAE柱，离心，去丙酮上G25柱脱盐，搜集第一峰，上DEAE柱分离，搜集第二峰，对蒸馏水透析过夜。

三换水，取样测粘蛋白抑制活性和标准胰蛋白酶活性，透析液调pH4，丙酮沉淀。继续测定标准酶活性和抑制活性，离心，搜集沉淀物4℃干燥。结束试验

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第25页试验二亲和层析纯化胰蛋白酶亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第26页1原理

鸡卵粘蛋白(ovomucoid,简称CHOM)，是胰蛋白酶天然抑制剂，在pH7.8-8.0缓冲溶液中二者发生专一性亲和作用。以鸡卵粘蛋白为配基，偶联在已经活化琼脂糖凝胶层析介质-Sepharose4B上，制备成鸡卵粘蛋白亲和层析介质（CHOM-Sepharose4B）。然后经过亲和层析法从胰蛋白酶粗提液中分离纯化胰蛋白酶。惯用载体活化与蛋配基偶联方法有环氧氯丙烷活化和溴化氰活化法。反应基本原理以下列图所表示：亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第27页1.1环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基偶联

↓活化

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第28页↓偶联

↓亲和结合

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第29页↓洗脱

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第30页1.2溴化氰活化载体

与蛋白质配基偶联

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第31页2亲和介质合成2.1琼脂糖凝胶层析介质(Sepharose4B)活化2.1.1琼脂糖凝胶层析介质处理称取10克琼脂糖凝胶层析介质，置于G-3玻璃烧结漏斗内，用100ml1.0mol/LNaCl溶液抽洗（少许屡次），100ml蒸馏水抽洗，抽干后转移到100ml三角瓶中备用。

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第32页2.1.2配方琼脂糖凝胶层析介质--QT410克蒸馏水7ml1,4二氧六环8ml2mol/LNaOH6.5ml

环氧氯丙烷1.5ml。

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第33页2.1.3活化将配制好介质三角瓶，放入45℃恒温水浴中，于160转/分钟，振摇活化2小时。停顿活化，转移到G-3玻璃烧结漏斗内，抽去活化剂，用100ml蒸馏水洗（少许屡次），转移100ml到三角瓶中，准备偶联。

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第34页2.2偶联

称取约100mg鸡卵粘蛋白，用10ml0.1mol/LpH9.5Na2CO3缓冲液充分溶解。取0.1ml稀释10倍测定OD280，计算溶液蛋白浓度。然后将溶解好鸡卵粘蛋白溶液，转移到100ml三角瓶中与活化琼脂糖凝胶介质混匀。在40℃恒温水浴中，于160转/分钟，振摇偶联22小时左右，停顿偶联。

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第35页2.3洗涤取一个洗净500ml抽滤瓶，将已经偶联好琼脂糖凝胶层析介质转移到G-3玻璃烧结漏斗内抽滤，搜集滤液，测定滤液中剩下鸡卵粘蛋白含量。用100ml1.0mol/LNaCl溶液抽洗，100ml蒸馏水抽洗，再用20ml亲和层析洗脱液洗涤。

将亲和介质转移到50ml小烧杯内，加入20ml亲和层析平衡液，浸泡20分钟，脱气，装柱。

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第36页3胰蛋白酶粗提液制备3.1胰蛋白酶基本性质3.1.1存在形式：胰蛋白酶通常是以胰酶原形式存在于动物胰脏或其它组织中。在底物诱导下或激活剂作用下，酶原C端水解，去6肽转变成含有活性胰蛋白酶。-6肽胰蛋白酶原胰蛋白酶Ca+2激活剂亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第37页3.1.2等电点与分子量：胰蛋白酶原pI=10.8，分子量：24000Da胰蛋白酶pI=8.9，分子量：23700Da

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第38页3.1.3稳定性胰蛋白酶在酸性环境中很稳定，在碱性环境中轻易自溶，在提取过程中要注意溶液pH值。

当溶液pH2.0轻易变性pH=3.0生物活性稳定pH7.0轻易自溶亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第39页3.2胰蛋白酶原提取(1)匀桨:取约30克猪胰脏，剥去结缔组织和脂肪，取净重20-25克左右,剪成碎块。转移到组织捣碎器内,加入150ml预冷3.5%乙酸酸化水,匀桨.(2)提取:转移到500ml烧杯中,用2mol/L硫酸调整pH值在3.5-4.0之间,10℃搅拌提取约4小时.(3)过滤:取一块纱布,折叠成四层,用水润湿,放在玻璃漏斗上,将胰蛋白酶原提取液过滤,搜集滤液.亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第40页(4)酸化:用2mol/L硫酸调整滤液pH值至2.5-3.0之间,4℃冰箱静止沉淀4小时以上。(5)过滤:折叠滤纸过滤,收滤液。

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第41页3.3胰蛋白酶原激活(1)调整pH值:用5mol/LNaOH将滤液准确调整pH值至pH8.0,量取溶液体积.(2)加激活剂:加入固体CaCl2使溶液Ca+2终浓度到达0.1mol/L,然后加入约5mg结晶胰蛋白酶,混匀,激活.(3)激活时间:在4℃冰箱内激活12-16小时,在25℃恒温水浴中激活2-4小时.亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第42页3.4停顿激活(1)活性测定:取1ml上清液分别测定蛋白浓度和活性.详细操作见活性测定部分.(2)停顿激活:等酶溶液比活性到达1000u/mg左右,用2mol/L硫酸调整pH值到3.0.(3)过滤:滤纸过滤,滤去CaSO4沉淀,搜集滤液,4℃冰箱保留.

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第43页4亲和层析分离胰蛋白酶(1)装柱:取一支层析柱(10×1.0cm),将合成好亲和层析介质CHOM-Sepharose4B装入柱内,自然沉降.(2)平衡:以0.1mol/L,pH8.0Tris-HCl缓冲液(内含0.5mol/LKCl,50mmol/LCaCl2)平衡.(3)上样:将以经激活胰蛋白酶提取液,用5mol/LNaOH准确调整pH值至pH8.0,滤纸过滤,取滤液上样.经过亲和介质偶联量和胰蛋白酶粗提液比活性,计算出上样所需体积.计算方法以下:

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第44页

偶联mg数×0.86×1.3×104(u/mg)上样体积(ml)=粗酶浓度(mg/ml)×比活(u/mg)亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第45页(4)平衡:

上完样以后,以0.1mol/L,pH8.0Tris-HCl缓冲液(内含0.5mol/LKCl,50mmol/LCaCl2)平衡,洗去未被吸附杂蛋白。(5)洗脱:

等平衡到基线稳定后,用0.1mol/L,pH2.5甲酸-0.5mol/LKCl溶液洗脱.搜集洗脱峰。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第46页(6)亲和层析洗脱曲线:亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第47页胰蛋白酶活性测定1胰蛋白酶活性测定1.1胰蛋白酶测定基本原理

胰蛋白酶是一个蛋白水解酶,它除了能水解碱性氨基酸与其它氨基酸形成肽键外,还能水解碱性氨基酸所形成酯键,催化活性含有高度专一性.所以,能够用人工合成N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-argineethylester,简称BAEE)为底物测定胰蛋白酶活性.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)在碱性条件下,经胰蛋白酶作用水解去一个乙基生成N-苯甲酰-L-精氨酸(BA),催化反应原理如图所表示。

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第48页因为BAEE在波长253nm处光吸收值远远弱于BA。所以，能够在加入酶为零点,测定在X分钟内递增吸光值.经过酶定义求出酶活性。

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第49页1.2测定胰蛋白酶活性定义底物浓度C=1mmol/L光程:L=1cm波长:λ=253nm1个BAEE单位温度:T=25℃体积:V=3ml递增值:ΔO.D=0.001A亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第50页1.3计算公式(1)活性单位ΔO.DBAEE单位(u/ml)=×N(稀释倍数)0.001

(2)比活性测得BAEE活性单位(u/ml)BAEE单位(u/mg)=

胰蛋白酶浓度mg/ml)×加入体积(ml)

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第51页2鸡卵粘蛋白活性测定

鸡卵粘蛋白是胰蛋白酶天然抑制剂,通常1μg鸡卵粘蛋白能抑制0.86μg胰蛋白酶活性(相当于1:0.86).在胰蛋白酶液中加入适量鸡卵粘蛋白,胰蛋白酶活性就会降低,胰蛋白酶递减活性就是鸡卵粘蛋白抑制活性.在一样条件下分别测定出未加鸡卵粘蛋白胰蛋白酶活性A1和加鸡卵粘蛋白胰蛋白酶活性A2.将A1-A2就能够得到鸡卵粘蛋白抑制活性.计算公式以下:亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第52页(1)抑制活性

A1–A2BAEE单位(Iu/ml)=×N(稀释倍数)0.001A1：胰蛋白酶活性A2：加鸡卵粘蛋白胰蛋白酶活性(2)抑制比活测得BAEE活性单位(Iu/ml)BAEE单位(Iu/mg)=

鸡卵粘蛋白浓度(mg/ml)×加入体积(ml)

亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第53页3蛋白质含量测定3.1消光系数定义：在蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，芳香族氨基酸在280nm处有最大吸收峰。蛋白质分子中含有芳香族氨基酸数量以及分子紧密程度有差异，在280nm处光吸收强弱不一样。在一定条件下，一个纯蛋白质在在280nm处光吸收值是一个常数。所以酶以纯蛋白质在280nm处都有一个消光系数A280。用符号表示为E1%1cm。这个符号定义是指在浓度为1%（W/V）蛋白质溶液中，测定光程为1cm条件下，该蛋白吸光值。亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介专家讲座第54页如:胰蛋白酶E1%1cm是13.5，是指胰蛋白酶浓度为1%(g/100ml)，光程为1cm时光吸收值A280=13.5。当胰蛋白酶浓度0.1g%(100mg/100ml)时，光程为1cm，光吸收值A280是1.35。当鸡卵粘蛋白浓度1%(g/100ml)时，A280是4.13，浓度1