抗生素发酵工艺

抗生素发酵工艺抗生素发酵工艺第1页一、概述

利用微生物技术，经过高度工程化新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，经过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药品产品生产。

绪论抗生素发酵工艺第2页二、抗生素发展史

我国早在宋朝真宗（998-1022）年代就开始利用接种人痘免疫技术预防天花病。1796年英国医生E.Jenner利用接种牛痘苗预防天花并取得成功。抗生素发酵工艺第3页

1929：Fleming在葡萄球菌培养皿中，污染霉菌周围出现透明抑菌圈。杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药品。1939：牛津病理家HowardFlorey，化学家ErnstChain，NormanHeatley.发酵瓶培养霉菌，培养里提取测活性，青霉素结晶。抗生素发酵工艺第4页1940:8只注射链球菌，提取物对4只治疗。未经治疗鼠在24小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。1941年2月开始治疗第一批人类病人。1943：威斯康辛大学小组，取得突破生产菌表面培养：几十个单位深层培养产黄青霉：100U/mlX、UV诱变育种：1000-1500U/ml不产色素变种：66000-70000U/ml抗生素发酵工艺第5页1941年，美国辉瑞制药企业开始介入青霉素试验性生产，使用了生产柠檬酸已经非常成熟通入无菌空气并进行搅拌深层发酵法。这种方法给发酵工业带来了革命性改变。自此以后制药业走进了抗生素时代我国微生物发酵制药工业起步较晚，1953年，我国第一家青霉素生产厂—上海第三制药厂才建成投产。1958年，我国最大抗生素制药企业—华北制药厂在石家庄建成投产，主要产品为青霉素、链霉素、土霉素和红霉素等。抗生素发酵工艺第6页三、抗生素药品分类抗细菌：青霉素、红霉素、四环素抗真菌：两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素抗肿瘤：丝裂霉素、诺卡霉素抗病毒：阿糖腺苷、金刚烷胺抗生素发酵工艺第7页四、微生物发酵研究范围微生物发酵制药是利用微生物进行药品研究、生产和制剂综合性应用技术科学。研究内容包含微生物制药用菌选育，发酵以及产品分离和纯化工艺等。主要讨论用于各类药品发酵微生物起源和改造、微生物药品生物合成和调控机制、发酵工艺与主要参数确实定、药品发酵过程优化控制、质量控制等。抗生素发酵工艺第8页

第一章微生物药品产生菌常见制药用微生物

细菌

放线菌

真菌抗生素发酵工艺第9页细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)抗生素发酵工艺第10页放线菌

抗生素1余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。抗生素发酵工艺第11页放线菌之诺卡氏菌属(Norcadia)生产利福霉素、蚊霉素等抗生素发酵工艺第12页放线菌之小单胞菌属(Micromonospora)各种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M.echinospora)产庆大霉素。抗生素发酵工艺第13页放线菌之游动放线菌属（Actinoplanes）经典代表：

济南游动放线菌(Actinoplanestsinanesisn)

产创新霉素(creatmycin；1964)抗生素发酵工艺第14页真菌之曲霉属(Aspergillus)生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。抗生素发酵工艺第15页真菌之青霉属(Penicillum)

产黄青霉(Penicillumchrysogenum)

生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸抗生素发酵工艺第16页真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)产黄头孢霉(Cephalosporiumchrysogen)、顶孢头孢霉菌(Cephalosporiumacremonium)

都生产头孢菌素C抗生素发酵工艺第17页第二节制药微生物育种菌种选育菌种筛选菌种保藏菌种退化和复壮抗生素发酵工艺第18页一、发酵菌种选育要求生产力：能在廉价培养基上快速生长，所需代谢产物产量高，其它类似代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素抗生素发酵工艺第19页发酵菌种选育方法从自然界中取得新菌种诱变育种杂交育种原生质体融合基因工程抗生素发酵工艺第20页（1）从自然界中取得新菌种土壤、空气、动植物等，严重污染水域，极端环境等基础程序：采样预处理富集培养筛选判定野生型菌株抗生素发酵工艺第21页（2）诱变育种物理或化学方法诱发突变物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线等化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等抗生素发酵工艺第22页杂交育种：借助有性重组，使不一样菌株遗传物质得以交换

原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质交换

基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广抗生素发酵工艺第23页二、菌种筛选（1）随机筛选

摇瓶筛选法、琼脂块筛选法（2）理性化筛选

筛选前体或前体结构类似物抗性突变株

筛选营养缺点型突变株抗生素发酵工艺第24页三、菌种保藏(Cultureconservation)目标：确保菌种经过较长时间后仍保持生活能力，预防被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。抗生素发酵工艺第25页

原理：依据微生物生理、生化特征，人工创造条件（如干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使微生物代谢活动处于不活泼状态，使其存活且得以延续。在进行保藏时最好是选取菌种休眠体，如芽孢、孢子。经过保藏能够降低微生物新陈代谢，降低菌种变异几率。抗生素发酵工艺第26页菌种保藏三要素经典菌种优良纯种休眠体；创造有利于种子休眠环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺乏营养）；尽可能采取各种不一样伎俩保藏同一菌株。抗生素发酵工艺第27页菌种保藏常见方法斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法抗生素发酵工艺第28页方法名称主要特点适用范围保藏期斜面低温保藏法传代培养，4℃保藏各种微生物短期保藏。1-6个月石蜡油封存法石蜡油隔绝空气，室温或4℃保藏各种微生物中短期保藏，不适用一些能分解烃类菌种。1-2年砂土管保藏法沙土管作载体，干燥器中抽真空，室温或4℃保藏产孢子微生物和芽孢细菌长久保藏，不适用对干燥敏感微生物1-麸皮保藏法麸皮作载体，干燥，4℃保藏产孢子霉菌和一些放线菌，工厂多采取此法1年甘油悬液保藏法悬浮于10-15%甘油中，需低温冰箱基因工程菌1年/冷冻真空干燥保藏法用保护剂制备悬液，快速冻结，减压抽真空，需冻干机各类微生物5-液氮超低温保藏法保护剂，超低温（-196℃），需超低温液氮设备各类微生物以上宿主保藏法与培养基混合直接低温保留专性活细胞寄生微生物（如病毒）抗生素发酵工艺第29页菌种保藏机构ATCC（美国经典菌种保藏中心）CMCC(中国医学微生物菌种保藏管理中心)NBRC(日本技术评价研究所生物资源中心)抗生素发酵工艺第30页四、菌种退化和复壮退化：

基因突变

连续传代

环境不良或污染了杂菌生产能力下降抵抗不良环境条件能力减弱抗生素发酵工艺第31页复壮纯种分离

粗放、精细寄主复壮选择适当培养条件

改变营养成份、酸碱度、培养温度抗生素发酵工艺第32页第二章培养基第一节培养基成份

标准：

依据菌种特征、微生物生长发育阶段、发酵产物特点等原因合理配制使用不一样成份及配比培养基，为微生物提供适宜营养物质，以满足菌体生长和合成产物需求。

抗生素发酵工艺第33页一、碳源

工业常见：

糖蜜（营养丰富，物美价廉）

玉米淀粉及其水解液（克服葡萄糖代谢过快弊病）

油脂（消除泡沫）

糊精第一节培养基成份抗生素发酵工艺第34页二、氮源有机氮源：

黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉无机氮源：

铵盐、硝酸盐、氨水抗生素发酵工艺第35页三、无机盐和微量元素磷（链霉素、四环素）硫（青霉素、头孢菌素）铁（青霉素、四环素、麦迪霉素）镁（卡那霉素、新生霉素、链霉素）锌（链霉素、青霉素）氯（金霉素、灰黄霉素）抗生素发酵工艺第36页四、前体

前体是指加入到发酵培养基中能够直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去而本身结构没有显著改变一类小分子物质。

注意：少许屡次

抗生素发酵工艺第37页五、促进剂和抑制剂

促进剂是指那些既不是营养物质又不是前体却能提升产物产量添加剂。

抑制剂是指在发酵过程中会抑制一些代谢路径进行，同时会使另一代谢路径活跃，从而取得大家所需某种产物或是正常代谢某一代谢中间产物积累起来。抗生素发酵工艺第38页六、生长因子

那些对微生物生长不可缺乏微量有机物质，微生物不能经过普通碳源、氮源合成这些物质，需另外添加，包含维生素、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱及其衍生物。抗生素发酵工艺第39页第二节培养基类型类别：按组成成份分

合成培养基：成份明确、稳定，多用于研究和育种，不适合大规模生产。

天然培养基：天然动植物产品，营养丰富、价格低廉、适于工业生产。抗生素发酵工艺第40页按培养基物理状态分固体培养基：适合菌种培养和保留半固体培养基液体培养基：适合发酵工业大规模使用抗生素发酵工艺第41页按培养基生产用途分孢子培养基

供菌种繁殖孢子用，常采取固体培养基。

条件：培养基营养不要太丰富

无机盐浓度适当

培养基PH值要适中

常见：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米培养基抗生素发酵工艺第42页二、种子培养基

种子培养基是供孢子萌发和菌种生长繁殖用培养基，营养成份要比较丰富、完全、易被菌体利用。

营养成份：葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硫酸铵等。抗生素发酵工艺第43页三、发酵培养基

发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物用培养基。

注意：碳氮源速效和迟效相互搭配，少用速效营养，多加迟效营养，百分比适宜。抗生素发酵工艺第44页第三节培养基设计与选择一、培养基设计

遵照标准：1、营养物质满足微生物生命活动需要2、营养物质浓度及配比适当3、PH值适宜4、符合培养目标5、原料起源广泛，价格合理抗生素发酵工艺第45页二、培养基选择1、液体培养基和固体培养基选择

液体培养基：种子培养及大规模发酵生产。

固体培养基：微生物菌种分离、纯化及保留、菌落特征判定、活细胞数目测定2、依据微生物营养特点选择培养基抗生素发酵工艺第46页3、依据生产实践和科学试验要求选择培养基4、考虑培养基成本

选择标准：

①产物或菌体得率大

②降低产品分离提纯成本

③生产能力最高

④副产品生成最少

⑤原料质量稳定，供给充分

⑥工艺过程较易进行抗生素发酵工艺第47页第四节影响培养基质量原因一、培养基组成配比影响二、培养基原材料质量影响三、水质影响四、灭菌影响五、其它原因影响抗生素发酵工艺第48页一、培养基组成配比影响氮源过多：菌体生长旺盛，PH值偏高，不利于代谢产物积累。氮源不足：菌体繁殖量过少，影响产量。碳源过多：PH值偏低。碳源不足：易引发菌体衰老和自溶。抗生素发酵工艺第49页二、培养基原材料质量影响

有机氮源（黄豆饼粉、玉米浆）、配制培养基（蛋白胨）、碳源（油脂）

消除标准：在工业生产中必须严加控制，按质量标准进行分析检验，合乎标准原材料方能使用。抗生素发酵工艺第50页三、水质影响

孢子培养基用蒸馏水货深井水，种子培养基、发酵培养基用深井水或自来水，发酵生产中有使用地表水，不过必要时要经过适当处理才能使用。抗生素发酵工艺第51页四、灭菌影响

严格控制灭菌操作，力争到达既灭杂菌又降低营养成份损失，对那些易降解或易发生化学反应组分应单独灭菌。抗生素发酵工艺第52页五、其它原因影响1、培养基PH值

培养基PH值调整应主要经过改变培养基营养物质浓度百分比，尤其是生理酸、碱性物质用量来完成。少许培养基PH值可用缓冲液加以缓冲。2、培养基黏度

黏度适宜抗生素发酵工艺第53页第三章灭菌第一节灭菌原理和方法

灭菌是指用物理或化学方法杀灭或除掉物料及设备中全部生命有机体过程。一、常见灭菌方法

化学物质灭菌辐射灭菌过滤介质灭菌加热灭菌（干热灭菌、湿热灭菌）抗生素发酵工艺第54页1、化学物质灭菌

试剂：甲醛、苯酚、高锰酸钾、新洁尔灭、乙醇、过氧乙酸、漂白粉等。

适用范围：生产环境或小型器具。不适合用于培养基灭菌。2、辐射灭菌

用于灭菌射线包含紫外线、X射线、γ射线，其中以紫外线最常见。

紫外线主要用于无菌室、培养间等空间灭菌。

抗生素发酵工艺第55页3、过滤介质除菌

主要用于澄清液体及气体除菌4、加热灭菌

（1）干热灭菌

火焰灭菌：

主要用于金属接种工具、试管口、锥形瓶口、接种移液管和滴管外部及无用污染物或试验动物尸体等灭菌。

金属小镊子、小刀、玻璃涂棒、载玻片、盖玻片灭菌时，应先将其浸泡在75%酒精溶液中，使用时从酒精溶液中取出来，快速经过火焰，瞬间灼烧灭菌。

抗生素发酵工艺第56页

热空气灭菌

生产上常见灭菌条件为160-170℃、1-1.5h。

（2）湿热灭菌

利用饱和蒸汽灭菌。广泛用于工业生产中大量培养基、设备、管路及阀门灭菌。抗生素发酵工艺第57页二、湿热灭菌原理

热阻:指某一微生物在某一个特定条件（主要是温度和加热方式）下致死时间。

相对热阻：指某一微生物在某条件下致死时间与另一微生物在相同条件下致死时间比值。抗生素发酵工艺第58页第二节培养基和发酵设备灭菌过程一、灭菌前准备工作

设备检验抗生素发酵工艺第59页二、培养基及发酵设备灭菌（一）空罐灭菌空罐灭菌又称空消，是指将饱和蒸汽通入未加培养基发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌过程。

优点：罐内死角少，蒸汽传热效率高，灭菌效果好。

适用范围：没有使用发酵罐、染菌罐、发酵罐更换菌种、培养基连续灭菌工艺、发酵罐及从属设备。抗生素发酵工艺第60页（二）实罐灭菌

实罐灭菌又称为分批灭菌，是将饱和蒸汽直接通入装有配制好培养基发酵设备中进行灭菌一个方法，简称实消。

优点：不需要专门灭菌设备，投资少，操作简单，灭菌效果可靠。

缺点：设备利用率较低；灭菌过程需要时间较长，培养基营养成份破坏较多。

该法多用于中小型发酵罐和种子罐灭菌。抗生素发酵工艺第61页注意：1、原料切忌结块，配料时应开动搅拌器，将各种粉饼块打坏、搅拌均匀。2、凡进口在培养基液面下管道应不停通入蒸汽，在液面上其余各管应排放蒸汽，这么才能确保灭菌彻底，不留死角。3、灭菌工程中要不时地搅拌，以利于泡沫破裂。抗生素发酵工艺第62页（三）连续灭菌

连续灭菌是将培养基在发酵罐外，经过专用灭菌装置，连续不停加热，维持保温和冷却后，送入已灭菌发酵罐内工艺过程，又称连消。

优点：发酵罐利用率高；热能利用较合理，适于自动化控制。

缺点：设备多，投资大，中小型发酵生产企业应用较少。抗生素发酵工艺第63页依据灭菌过程中使用设备及工艺，将连消分为三种形式：1、由连消塔、维持罐和冷却器组成灭菌系统

该灭菌系统使用设备包含：配料罐、连消塔、维持罐、冷却器。2、蒸汽喷射连续灭菌系统

喷射式加热器在我国大多数发酵工厂采取培养基加热装置。3、由热交换器组成灭菌系统

板式热交换器传热系数大，流程利用合理，节约大量蒸汽和冷却水，因而广泛利用。

抗生素发酵工艺第64页抗生素发酵工艺第65页三、发酵罐从属设备、空气过滤器及管路等灭菌（一）发酵罐从属设备灭菌

包含补料罐、计量罐和油罐等。

空罐灭菌使罐内蒸汽压力到达1.5×105Pa，保温45min。

补料罐实罐灭菌条件应视物料性质而定。抗生素发酵工艺第66页（二）空气过滤器灭菌

灭菌时，总蒸汽压力为（3-3.5）×105Pa，总过滤器保温灭菌时间为1.5-2h，吹干时间为2-4h；中小型过滤器普通保温45-60min，吹干需1-2h。抗生素发酵工艺第67页（三）管路灭菌

管路灭菌所用蒸汽压力普通为（3-3.5）×105Pa，灭菌保温时间为1h抗生素发酵工艺第68页二、培养基及发酵设备灭菌（一）空罐灭菌

定义：又称空消。是指将饱和蒸汽通入未加入培养基发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌过程。

优点：空罐灭菌时，罐内死角少，蒸汽传热效率高，灭菌效果好。

抗生素发酵工艺第69页第三节常见灭菌问题分析及处理一、影响培养基灭菌原因

①培养基成份

油脂、糖类、蛋白质、有机物需要灭菌温度高；盐类、色素有利于灭菌进行。

②PH值

培养主动PH值愈低，灭菌所需时间愈短。

③培养基中颗粒大小

＜1mm颗粒影响不大。

④泡沫

加入少许消泡剂

抗生素发酵工艺第70页二、灭菌过程中常见问题及处理方法①灭菌后培养基质量差

控制好灭菌温度及灭菌时间、调整好原料灭菌次序②空气突然中止

关闭个空气进气阀。处理次序：发酵罐→种子罐→补料罐→消沫剂罐→计量罐。

③蒸汽压力改变④空气过滤器压差过大

⑤饱和蒸汽温度与压力不对应

⑥消后培养基带菌：设备损坏、密封不严以及空气过滤系统带菌等抗生素发酵工艺第71页

第四章种子扩充培养

种子制备是指由保藏菌种开始，经过不停扩充培养，使菌体数量到达能够满足生产中发酵罐或者试验室摇瓶发酵接种量需要所包括菌种培养过程。抗生素发酵工艺第72页适合于工业化发酵生产种子必须满足以下条件：1、生长活力强，移种至发酵罐后能快速生长，延滞期短。2、菌体生理特征及生产能力稳定。3、菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量要求。4、无杂菌污染。抗生素发酵工艺第73页

以抗生素发酵生产种子制备过程为例：

其种子制备普通包含在固体培养基上生产大量孢子制备过程和在液体培养基中培养大量菌丝种子制备工程。抗生素发酵工艺第74页第一节固体孢子制备

普通繁殖能力强、孢子数量多菌种可用固体孢子进罐。一、孢子制备过程1、霉菌孢子制备

多数采取大米、小米、麦麸之类自然培养基。

优点：培养基简单易得、成本低、培养基比表面积大，取得孢子数量比营养琼脂斜面多。抗生素发酵工艺第75页e.g产黄青霉菌(P.chrysogonum)

原始菌种→斜面试管→取得孢子→250ml茄子瓶（大米或小米）25~28℃

，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保留）。抗生素发酵工艺第76页

对于不产孢子赤霉素生产菌（Gibberellinefujikuroi），也可用大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。产孢子能力不强或孢子发芽慢菌种，如产链霉素灰色链霉菌（S．griseus

），产卡那霉素卡那链霉菌（S．kanamyceticu），能够用摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基摇瓶中，于摇床上培养，取得菌丝体，作为种子。不产孢子细菌，如生产谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上普通采取斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，取得细胞悬液再接种。抗生素发酵工艺第77页2、放线菌孢子制备

放线菌孢子多数采取琼脂斜面培养基来制备，培养基中含有适合产孢子营养成份，如麸皮、蛋白胨和一些无机盐类物质等。

放线菌发酵生产工艺流程：①沙土管→母斜面→子斜面→种子罐→发酵罐②沙土管→母斜面→摇瓶菌丝→种子罐→发酵罐抗生素发酵工艺第78页3、细菌孢子制备

发酵生产工艺流程：

安剖管→斜面F1（第一代）→斜面F2（第二代）→种子罐→发酵罐

细菌培养温度多为37℃，培养时间普通为1-2天。抗生素发酵工艺第79页二、孢子制备技术关键点1、霉菌类

菌落分散、挑选菌落中央孢子、孢子悬液浓度适当、混合均匀。2、放线菌类、细菌类

灭菌后琼脂培养基在放凉且未凝固时摆成斜面。待斜面凝固后置37℃培养2-3天，经检验无杂菌和无冷凝水后备用。

抗生素发酵工艺第80页第二节液体种子制备

液体种子制备是将固体培养基上培养好孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体过程。

生产种子制备包含：摇瓶种子制备和种子罐种子制备。抗生素发酵工艺第81页一、摇瓶种子制备

将斜面种子或米孢子接种入装在锥形瓶内液体营养培养基中，在摇床上进行振荡培养所取得液体种子，称作摇瓶种子。1、工艺流程

培养基配制→分装→灭菌→接种→恒温振荡培养→摇瓶种子

斜面种子或米孢子抗生素发酵工艺第82页2、培养基配制

培养基配方和培养条件与种子罐相同，要求氮源丰富，利于菌丝生长。3、接种

采取菌悬液接种法，即用无菌蒸馏水将斜面种子或米孢子粒上细胞或孢子洗下，制成细胞或孢子悬液，按一定题解或者一定细胞数接种至摇瓶种子培养基中。4、培养

摇瓶种子在恒温摇床上进行培养。摇床分旋转式和往复式，抗生素工厂普通采取是旋转式。抗生素发酵工艺第83页5、保留

摇瓶种子应该在培养成熟后马上使用。假如不使用，可置4℃冰箱中保留，保留期最好不要超出3天。抗生素发酵工艺第84页二、种子罐种子制备

种子罐作用是使接入种子罐内数量有限孢子发芽、生长并繁殖成大量菌体，满足接种发酵罐需要。

孢子或者摇瓶菌丝接入到体积较小种子罐中，经过培养后形成大量菌丝，该种子称为一级种子。

把一级种子转入到发酵罐内发酵，称为二级发酵。

种子罐级数越少越好，原因：

1、简化生产工艺和控制

2、降低接种带来染菌机会

抗生素发酵工艺第85页

接种量(seedvolume)指移入种子体积和接种后培养液体积比。

接种量大小决定于生产菌种在发酵罐中繁殖速度。采取较大接种量能够缩短发酵罐中菌体繁殖抵达高峰时间，使产物形成提前。原因：1、种子多，种子液中含有大量胞外水解酶，有利于对基质利用２、生产菌快速占据了整个培养环境，降低染菌机会。但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。

e.g.嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶接种1%，酶活最高；1.5%~4%影响不大；大于4%，酶产量显著下降。抗生素发酵工艺第86页第三节种子质量控制与分析

发酵生产水平

种子质量

菌体本身遗传特征和培养条件抗生素发酵工艺第87页一、影响孢子质量原因及其控制1、培养基①原材料产地、品种、加工方法以及用量②水质（地域、季节和水源污染）③菌种不一样④氮源品种抗生素发酵工艺第88页2、培养条件①温度

培养温度控制低一些，有利于孢子形成。②湿度

在北方相对湿度控制在40%-45%，而南方相对湿度控制在35%-42%，所得孢子质量很好。

真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。③培养时间

过于年轻孢子经不起冷藏，过于衰老孢子会造成生产能力下降，孢子培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常阶段终止培养。抗生素发酵工艺第89页④接种量

普通传代用斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代培养。接种摇瓶或进罐斜面孢子，要求菌落密度适中或稍密，孢子数到达要求标准。抗生素发酵工艺第90页二、影响种子质量原因及其控制1、培养基

要求

氮源和维生素含量较高；营养成份尽可能与发酵培养基靠近。2、培养条件

选择最适温度；前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量；补料工艺3、种龄

在工业发酵生产中，普通都选在生命力最旺盛对数生长久，菌体量还未到达最高峰时移种。抗生素发酵工艺第91页4、接种量

多数抗生素发酵接种量为7%-15%，有时可加大到20%-25%。抗生素发酵工艺第92页三、种子质量标准1、种子生长情况

菌体形态、菌体浓度以及培养液外观，是种子质量主要指标。2、营养物质含量与PH值改变3、产物生产量4、特殊酶活力抗生素发酵工艺第93页四、种子异常分析1、菌种生长发育迟缓或过快

通入种子罐无菌空气温度较低或培养基灭菌质量较差是种子生长、代谢迟缓主要原因。2、菌丝结团

菌丝结团和搅拌效果差、接种量小相关。3、菌丝黏壁

菌丝黏壁主要原因是搅拌效果不好，搅拌时泡沫过多，以及种子罐装料系数过小等。抗生素发酵工艺第94页第四节青霉素生产种子制备制备过程

安剖管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵抗生素发酵工艺第95页一、斜面孢子

培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等

培养条件：25℃、7天、湿度50%

培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细抗生素发酵工艺第96页二、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养条件：25℃、7天、控制湿度培养基特点：成本低、米粒之间结构疏松提升比表面积和养传质，营养适当（要求大米白点小）有利于孢子生长。抗生素发酵工艺第97页3、一级种子

培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆

培养条件：27℃，40小时

接种量：200亿孢子/吨

目标：长菌体4、二级种子

培养基：同上

培养条件：27℃、10-14小时

接种量：10%抗生素发酵工艺第98页种子质量要求

菌丝长稠呈丝状、菌丝团极少，有中小空孢，处于3-4期。

青霉素发酵菌丝体生长久共分6期，1-4期为年青期，4-6期合成青霉素能力最强。抗生素发酵工艺第99页第五章无菌空气制备

第一节过滤除菌基础原理一、基础概念

无菌空气：指不含有微生物菌体空气。

深层过滤：利用介质纤维层层阻隔，迫使空气在流动过程中出现无数次改变汽速大小和方向绕流运动，造成微粒与滤层纤维间产生撞击、拦截、布朗扩散、重力及静电引力等作用，从而把微粒截留、捕集在纤维表面上，实现了过滤除菌目标。抗生素发酵工艺第100页二、深层介质过滤除菌原理

扩散截留效应

重力沉降截留效应

惯性冲击截留效应

拦截截留效应

吸附截留效应抗生素发酵工艺第101页第二节常见过滤介质一、纤维过滤介质1、棉花

要求新鲜，纤维长二疏松，填充均匀，最终压紧，不得使用脱脂棉。2、玻璃纤维

阻力小抗生素发酵工艺第102页二、颗粒活性炭过滤介质

该介质过滤强度高，表面积大，空隙大，阻力小，过滤效率低，只有棉花阻力1/12，常与棉花配合使用。

抗生素发酵工艺第103页三、纸过滤介质1、超细玻璃纤维过滤

用无碱玻璃，喷吹成丝状纤维，属高气速过滤，气流速度越高，效率越高。不过其强度高，易断，多用于分过滤器。可采取办法：①环氧树脂；②多层复合使用。2、聚丙烯纤维滤纸

结构强度好，不易被水汽浸润。抗生素发酵工艺第104页四、板过滤介质1、石棉滤板

对人体危害较大，当前使用已经较少。2、烧结金属板

金属粉末颗粒经烧结形成多孔固体材料。抗生素发酵工艺第105页五、膜过滤介质

膜过滤是靠近于绝对过滤原理过滤方式，可完全截留病毒、噬菌体、微生物孢子等微小生物体。耐121℃重复蒸汽灭菌，公认最安全，保险。1、PVDF2、HFGF3、PTFEMilipore企业：孔径0.1-0.22μ，小于细菌直径。Domnick-Huntev企业：0.01μ，小于噬菌体。抗生素发酵工艺第106页第三节无菌空气制备过程1、空气除菌流程：

空气→高空取气管→除尘器→空气压缩机→贮气罐→一级冷却器→油水分离器→二级分离器→除雾气→加热器→总过滤器→分过滤器→无菌空气进发酵罐抗生素发酵工艺第107页一、空气预处理过程1、空气采集和压缩

采集：空气采集口普通设置距离地面最少10-15m，远离尘埃集中位置，尽可能设置于上风口方向；空气自采集口进入空气压缩机前先经过粗过滤装置去除大尘埃颗粒。

压缩：涡轮空压机和往复式空压机抗生素发酵工艺第108页2、压缩空气除油水

气液分离器：旋风分离器和丝网过滤器，普通联合使用。抗生素发酵工艺第109页3、空气再加热

热交换器或空压机输送高温压缩空气与冷却空气进行热量交换抗生素发酵工艺第110页二、空气过滤除菌1、发酵车间设置总过滤器一组，对预处理后压缩空气进行粗过滤，总过滤器主要使用膜过滤装置。2、进入发酵罐之前设置分过滤器，普通由预过滤器和精过滤器组成。预过滤器目标保护精过滤器；精过滤器目标完全滤除空气可能含有为生物体，确保进罐空气到达工艺无菌要求。

抗生素发酵工艺第111页第四节无菌空气微生物检测

空气微生物检测方法有平皿沉降法和采样培养法两大类型。

平皿沉降法依靠空气中微生物体自然沉降于琼脂平板上，用过一定时间搜集后培养计数。

采样培养法则经过采集装置主动采集空气中微生物离子，经过培养检测空气中微生物含量水平。抗生素发酵工艺第112页

实际操作中，考虑到无菌压缩空气特殊性，普通不采取普通空气微生物采集方法。采取方法主要有液体吹气培养法和液体吹气-平皿培养法。抗生素发酵工艺第113页第六章微生物药品生物合成第一节微生物代谢代谢初级代谢：微生物用于本身生长繁殖营养物质分解合成。次级代谢：一些微生物生长到稳定时后以结构简单、代谢路径明确、产量较大初级代谢产物为前体，经过复杂次生代谢路径所合成各种结构复杂化合物。抗生素发酵工艺第114页二、微生物初级代谢和次级代谢关系项目初级代谢次级代谢功效代谢产物主要针对生长必须小分子化合物如：氨基酸、核苷酸、维生素等，是合成生物大分子材料或辅酶；在各种生物中相近或相同代谢产物非生长必需，但功效对产生菌在自然环境中生存有益，化学结构往往比较复杂，且种类繁多；具种属甚至菌株特异性。合成过程包含主要碳氮代谢路径，在各类生物中基础相同是初级代谢路径延伸，合成路径复杂，具特异性初级代谢和次级代谢路径亲密相关，所包括酶系和调控机制也是相互交织，彼此影响。抗生素发酵工艺第115页项目初级代谢次级代谢合成时期主要在生长久合成往往在生长停顿后开始从初级代谢向次级代谢转换一些环境条件调控，主要是营养限制或代谢产物累积限制合成专一性普遍存在，各种生物都能合成，只是速率不一样，酶反应含有高度专一性产物合成含有显著种属特异性，产物往往以一族化合物形式出现。合成条件普通只需简单营养条件，在各种可生长环境中代谢物均能形成常需要复杂营养条件，甚至需供给复杂天然物质，产物只能在一些特定培养条件下合成遗传控制主要受染色体DNA控制受染色体DNA和质粒DNA控制抗生素发酵工艺第116页第二节微生物药品生物合成基础路径一、微生物次级代谢产物生物合成基础特征①合成滞后性②受初级代谢调整性③菌种与产物不对应性④代谢产物不确定性⑤代谢产物合成不稳定性抗生素发酵工艺第117页二、次级代谢产物生源1、聚酮体2、糖类3、肽类抗生素中不常见氨基酸4、非核酸嘌呤碱和嘧啶碱5、吩恶嗪酮6、莽草酸7、甲羟戊酸抗生素发酵工艺第118页1、聚酮体聚酮体即含多个羰基聚合物聚酮体组成单位

乙酸、丙酸、丁酸和短链脂肪酸

聚酮体起始单位

乙酰辅酶A、丙酰辅酶A、丙二酰胺辅酶A和丁酰辅酶A等聚酮体延伸单位

丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A等抗生素发酵工艺第119页抗生素发酵工艺第120页抗生素发酵工艺第121页抗生素发酵工艺第122页抗生素发酵工艺第123页3、肽类抗生素中不常见氨基酸抗生素发酵工艺第124页抗生素发酵工艺第125页抗生素发酵工艺第126页二、次级代谢产物生物合成基础路径1、前体聚合2、修饰3、不一样组分装配抗生素发酵工艺第127页抗生素发酵工艺第128页抗生素发酵工艺第129页抗生素发酵工艺第130页抗生素发酵工艺第131页第三节微生物次级代谢产物生物合成调整机制1、初级代谢对次级代谢调整2、碳代谢物调整3、氮代谢物调整4、磷酸盐调整5、ATP调整6、酶诱导调整7、反馈调整8、细胞膜通透性调整9、金属离子和溶解氧调整抗生素发酵工艺第132页初级代谢调控机制1、酶活力调整

酶激活和抑制2、酶合成调整

酶诱导和阻遏抗生素发酵工艺第133页1、初级代谢对次级代谢调整当初级代谢与次级代谢含有共同路径，而初级代谢产物过量时，往往会抑制次级代谢产物合成。抗生素发酵工艺第134页2、碳代谢物调整速效碳源—葡萄糖效应，普通情况下，凡能被微生物快速利用、促进菌体快速生长碳源，对次级代谢产物合成都表现出抑制作用。是葡萄糖降解产物抑制了包含几乎全部微生物药品次级代谢产物合成。调整方式：少许屡次流加；菌体生长和产物发酵其采取不一样碳源。抗生素发酵工艺第135页3、氮代谢物调整研究发觉：高浓度铵离子抑制次级代谢产物合成是一个普遍特征；无机氮源或简单有机氮源能促进菌体生长，却不利于次级代谢产物合成；而利用较慢氮源能够预防和减缓但代谢物阻遏作用，从而有利于次级代谢产物合成。其调整应针对不一样氮源区分对待。菌体生长久能够添加无机铵盐，而产物合成期采取复杂氮源。抗生素发酵工艺第136页4、磷酸盐调整促进初级代谢，抑制次级代谢抑制次级代谢产物前体形成阻遏次级代谢产物合成中一些关键酶合成抑制碱性磷酸酯酶合成增加菌体能荷状态以促进初级代谢抗生素发酵工艺第137页5、ATP调整ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中一些酶活性。以四环素合成为例：抗生素发酵工艺第138页6、酶诱导调整在次级代谢过程中，有些参加次级代谢产物合成酶为诱导酶，需要有诱导物存在时才能合成。诱导物普通为酶底物或底物类似物。有些需外源加入，有些能够内源产生。抗生素发酵工艺第139页7、反馈调整与初级代谢产物调整机理类似，诱导调整经过底物（诱导剂）诱导后，特异性酶才会被诱导产生；反馈调整则是因为产物过量积累造成。抗生素发酵工艺第140页8、细胞膜通透性调整经过调整膜通透性，影响摄入前体或排出产物而加速次级代谢产物合成，提升其产量。抗生素发酵工艺第141页9、金属离子及溶解氧调整金属离子，尤其是二价阳离子，如Ca2+

、Mg2+

能够解除产生菌对所产抗生素特异性吸附作用，使抗生素从菌丝上游离下来，促进产物分泌。抗生素发酵工艺第142页第七章微生物发酵及工艺控制第一节发酵过程原理一、发酵基础概念1、微生物发酵

利用微生物体来制得产物需氧或厌氧任何过程。2、初级代谢产物

关系到微生物新陈代谢过程中能量代谢、细胞生长和细胞结构代谢产物。3、次级代谢产物

微生物菌体在生长久不能合成、普通在菌体生长静止期中合成与菌体成长繁殖无显著关系产物。抗生素发酵工艺第143页二、发酵基础类型1、生长关联型

特点：菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同时间出现高峰。2、生长个别关联型

特点：发酵第一时期菌体快速增加，而产物形成极少或全无；在第二时期，产物以高速度形成，生长也可能出现第二个高峰。3、非生长关联型

特点：产物形成普通在菌体生长靠近或到达最高生长时期，即稳定时抗生素发酵工艺第144页三、发酵方法微生物发酵有三种方式：

分批发酵（batchfermentation）

补料分批发酵（fed-batchfermentation）

连续发酵（continuousfermentation）

工业上预防出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大都采取分批发酵或补料分批发酵这两种方式。抗生素发酵工艺第145页三、发酵方法1、分批式发酵（batchfermentation）①理论基础把培养液一次性装入发酵罐，灭菌后接入一定量种子液，在最正确条件下进行发酵培养。②操作过程大型发酵罐，普通不在罐内对培养基灭菌，而是利用专门灭菌装置对培养基进行连续灭菌。③优缺点：发酵周期短，产品质量易控制，不易发生杂菌污染，对原料组成要求较粗放。发酵体系中开始时基质浓度很高，到中后期营养物质浓度很低，这对发酵反应不利。

抗生素发酵工艺第146页2、流加式发酵①理论基础在分批式操作基础上，开始时投入一定量基础培养基，到发酵过程适当初期，开始连续补加碳源或氮源或其它必需物质，但不取出培养液，直到发酵终点，产率达最大化，停顿补料，最终将发酵液一次全部放出。②操作过程操作形式有两种：反馈控制和无反馈控制。无反馈控制包含定流量和定时间流加。反馈控制依据反应体系中酸性物质浓度来调整流加速率。抗生素发酵工艺第147页③优缺点：优点：在发酵过程中慢慢地加入培养基，使其在发酵液中保持适宜水平，同时又稀释了生成产物浓度，防止了高浓度产物和底物抑制作用，也预防了后期养分不足而限制菌体生长。缺点：受发酵罐操作容积限制

抗生素发酵工艺第148页3、半连续式发酵①概念菌体和培养液一起装入发酵罐，在菌体生长过程中，每隔一定时间取出个别发酵培养物，同时补充同等数量新培养基，然后继续培养，直到发酵结束，取出全部发酵液。②优点：保持培养液总体积不变，同时可起到解除高浓度基质和产物对发酵抑制作用。抗生素发酵工艺第149页4、连续式发酵

菌体与培养液一起装入发酵罐，在菌体培养过程中不停补充新培养基，同时取出包含培养液和菌体在内发酵液，发酵体积和菌体浓度等不变，使菌体处于恒定状态发酵条件，促进菌体生长和产物积累。抗生素发酵工艺第150页连续发酵控制方式：

①恒浊法：利用浊度来检测细胞生长情况，经过自控仪表调整输入料液流量，以控制培养液中菌体浓度到达恒定值。

②恒化器法：经过恒定输入养料中某一个生长限制基质浓度来控制。抗生素发酵工艺第151页①单级连续发酵

连续发酵到达稳态时放掉发酵液中细胞量等于生成细胞量。抗生素发酵工艺第152页②多级连续发酵

增加罐级数和将菌体送回罐内抗生素发酵工艺第153页③连续式发酵优缺点优点：产率、生产质量、生产能力、生产稳定性、设备利用率和易于实现自动化方面比分批式发酵优越；还能够不停收获产物，提升菌体密度。缺点：杂菌污染机会增多，细胞易发生变异和退化。抗生素发酵工艺第154页适用范围生产能力大，微生物变异小，酶活稳定，产品需连续处理工业体系，仅限用于纯培养要求不高情况。抗生素发酵工艺第155页第二节发酵条件影响及其工艺控制常规发酵条件：罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体等设定和控制。能表征过程性质状态参数：PH值、溶氧、溶解CO2、氧化还原电位、尾气O2和CO2含量、基质或产物浓度、代谢中间体或前体浓度、菌体浓度抗生素发酵工艺第156页一、温度影响和控制1、温度对发酵影响

①温度影响微生物发酵化学反应速度

②温度影响发酵液物理性质

③温度改变产物合成方向、稳定性

④温度选择还应参考其它发酵条件，灵活掌握抗生素发酵工艺第157页2、温度控制

工业生产上，大发酵罐在发酵过程中普通不需加热，因发酵过程释放了大量发酵热，需冷却情况较多。抗生素发酵工艺第158页抗生素发酵工艺第159页二、PH值影响和控制1、PH值对发酵影响

①PH值影响细胞内各种酶催化活力产生影响。

②PH值影响膜电位和细胞跨膜运输

③PH值改变造成发酵产物稳定性改变，影响其积累

④PH值影响细胞表面电荷，关系到细胞结团或絮凝抗生素发酵工艺第160页2、PH值控制

发酵过程中PH值可经过直接补加生理酸性物质或生理碱性物质和补料方式来控制。

补料方法能够实现补充营养、延长发酵周期、调整PH值和培养液特征。抗生素发酵工艺第161页三、溶氧影响和控制1、溶氧影响

①溶氧直接影响菌体生长

②溶氧对产物形成影响是多样性

抗生素发酵工艺第162页2、溶氧控制

发酵溶氧浓度是由供氧和需氧两方面决定。普通经过搅拌转速或通气量来控制供氧。发酵液需氧量受菌体浓度、基质种类和浓度以及培养条件等原因影响。抗生素发酵工艺第163页四、二氧化碳影响与控制1、二氧化碳影响

①二氧化碳直接影响菌体生长

②二氧化碳影响产物形成抗生素发酵工艺第164页2、二氧化碳控制

生产上普通采取调整搅拌速率及通气量方法控制调整液相中二氧化碳浓度抗生素发酵工艺第165页五、加料方式影响和控制1、加料方式影响

加料方式有三种：一次性加料、一次性投入主料中间补料、连续加料。普通普遍使用是一次性投入主料中间补料。抗生素发酵工艺第166页2、加料方式控制

补料操作控制系统分为反馈控制和无反馈控制。

利用排气中二氧化碳含量作为反馈控制参数中较常见间接方法抗生素发酵工艺第167页六、泡沫影响和控制1、泡沫对发酵影响

①增加氧在发酵液中传递

②不利于菌体生长

③降低了发酵罐装料系数

④增加染菌机会

⑤降低发酵物产量抗生素发酵工艺第168页2、泡沫控制

菌体特征、机械消泡、消泡剂消泡抗生素发酵工艺第169页对微生物、人无毒性对产物提取不产生任何影响能耐高温灭菌起源方便、成本低对氧传质不产生影响使用、运输过程中无任何危害低浓度是含有消泡活性快速、持久消泡抗生素发酵工艺第170页七、罐压控制和影响1、罐压控制

①罐压影响二氧化碳和氧气溶解度

②影响微生物生长抗生素发酵工艺第171页2、罐压控制

控制罐压方法普通为调整空气进口阀门或排气出口阀门开启度，改变进入或排出气体流量、维持工艺所需压力。抗生素发酵工艺第172页八、搅拌影响和控制搅拌影响气体传递速度和发酵液混合均匀程度。反应搅拌指标有搅拌转速和搅拌功率。抗生素发酵工艺第173页第三节发酵过程中间分析代谢参数按性质分：

物理参数：温度、搅拌速度、空气压力、空气流量、溶氧浓度、表观黏度、排气氧（二氧化碳）浓度。

化学参数：基质浓度、（糖、氮、磷）、PH值、产物浓度、核酸量。

生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力抗生素发酵工艺第174页按检测伎俩分：

直接参数：温度、PH值

间接参数：KL、摄氧率直接参数：

在线检测参数：温度、PH值、搅拌转速

离线检测参数：残糖、氨基氮、菌体浓度抗生素发酵工艺第175页一、发酵过程主要分析项目1、PH值

影响酶催化活性、基质代谢、产物合成、细胞状态、营养情况、供养情况

测定方法：离线精密PH试纸法、PH计法、PH在线电极测定法

抗生素发酵工艺第176页2、排气氧、排气二氧化碳和呼吸熵

排气氧反应菌生长活性；

排气二氧化碳反应微生物代谢情况；

呼吸熵反应氧利用情况。抗生素发酵工艺第177页3、糖含量

糖消耗反应产生菌生长繁殖情况，反应产物合成活力。糖含量测定，能够控制菌体生长速率，可控制补糖来调整PH值，促进产物合成，不至于盲目补糖，造成发酵不正常。

糖含量测定包含总糖和还原糖。

抗生素发酵工艺第178页4、氨基氮和氨态氮

经过氨基氮和氨态氮分析可控制发酵过程，适时采取补氨办法。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，不然影响提取过程。抗生素发酵工艺第179页5、磷含量

磷是核酸组成个别，是高能化合物ATP组成个别，磷还能促进糖代谢。抗生素发酵工艺第180页6、菌浓度和菌形态

菌浓度和菌形态直接反应菌生长情况，

菌浓度测定经过有测黏度法、压缩体积法、静置沉降体积法、光密度测定法（分光光度计、光电比色计）抗生素发酵工艺第181页7、产物浓度

产生菌合成能力和产物积累情况都要经过产物量测定来了解，产物浓度直接反应了生产情况，是发酵控制主要参数。抗生素发酵工艺第182页二、产物量测定（一）产物量特殊表示法1、抗生素效价

抗生素效价表示抗生素有效成份多少，效价大小用单位（U）来表示。2、酶活力

在25℃下，在最适底物浓度、最适缓冲液离子强度以及最适PH值条件下，每分钟能转化1μmol分子底物酶量为一个活力单位。抗生素发酵工艺第183页（二）产物量测定方法1、化学法

①滴定法

②比色法

③压差法2、物理法

旋光度3、生物法

适合用于抗生素效价测定，常见于发酵终了产品效价测定。抗生素发酵工艺第184页第四节发酵染菌预防和处理一、染菌路径分析

染菌路径：

①种子包含进罐前菌种室阶段出问题

②培养基配制和灭菌不彻底

③设备上尤其是空气除菌不彻底和过程控制操作上疏漏。抗生素发酵工艺第185页种子带菌检验可从菌种室保藏菌种、斜面、摇瓶直到种子罐。培养基带菌原因如蒸汽压力或灭菌时间不够，培养基配料未混合均匀，存在结块现象，设备未清洗洁净，尤其是罐冲洗不到死角处，有结痂而未铲除洁净。设备方面尤其是老设备带菌，原因主要是夹层或盘管、轴封和管道渗漏、空气除菌效果差，管道安装不合理，存在死角等。抗生素发酵工艺第186页二、染菌判断镜检或无菌试验状态参数（溶氧改变规律）发酵液观察抗生素发酵工艺第187页三、预防和处理染菌方法

预防染菌关键是加强技术管理、细化各种预防办法、并做到日常化、制度化、规范化。（一）重视日常工作①检验空气冷却器、空气夹套加热器、分预过滤器运行情况。②空气除菌过滤器定时灭菌。③观察总蒸汽温度和压力是否对应，确保蒸汽为饱和蒸汽。④定时拆检连消塔、维持罐，检验内件坚固情况，及时清理内垢。检验喷淋冷却管路及无聊管路上相关阀门泄露情况。抗生素发酵工艺第188页⑤强化菌种保藏管理，严格执行无菌室管理制度。⑥认真做好罐清理、冲洗工作，去除死角。⑦定时进行碱水煮罐。⑧依据培养基情况选择正确灭菌形式。⑨严格按标准操作规程进行灭菌操作，合理控制灭菌指标在要求范围，防止超标。⑩对发酵辅助设备仪表进行定时保养和检修。抗生素发酵工艺第189页（二）异常情况处理（1）对染菌罐放罐后处理

对各阀门打压试漏并拆检相关设备（2）种子培养期染菌处理

种子灭菌弃之并对种子罐及管道进行检验灭菌（3）发酵早期染菌处理

适当改变生长参数，使有利于生产菌而不利于杂菌生长；依情况而定，重新进行灭菌，再接种。

（4）发酵中后期染菌处理

加入抗生素或杀菌剂

抗生素发酵工艺第190页

（5）噬菌体污染预防及处理①并罐法②轮换使用菌种或使用抗性菌株③放罐重消④罐内灭噬菌体法抗生素发酵工艺第191页第八章几个主要微生物药品发酵工艺一、青霉素发酵工艺

青霉素是抗菌素一个，是指从青霉素培养液中提制分子中含有青霉烷、能破坏细菌细胞壁并在细菌细胞繁殖期起杀菌作用一类抗生素，是第一个能够治疗人类疾病抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素总称。抗生素发酵工艺第192页

理化性质溶解性吸湿性稳定性聚合反应过敏反应降解反应抗菌活性抗生素发酵工艺第193页1、溶解性

青霉素是一个有机酸，易溶于醇、酸、醚、酯类，在水中溶解度很小，且会快速丧失其抗菌能力。青霉素金属盐极易溶于水，几乎不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂。2、吸湿性

结晶内在质量、晶形和品种均影响吸湿性。青霉素钠盐、胺盐、钾盐吸湿性依次减小。因为钠盐比钾盐更不易保留，要求包装严密，以免吸湿变质。抗生素发酵工艺第194页3、稳定性

普通青霉素越纯、越干燥、稳定性越强。普通要求使用期为4年。因为青霉素水溶液很不稳定，普通都用固体保留。4、降解反应

青霉素分子中最不稳定部位是β-内酰胺环，而其抗菌作用恰恰决定于β-内酰胺环完整。抗生素发酵工艺第195页5、聚合反应

青霉素水溶液很轻易形成聚合物。它们是青霉素过敏反应主要过敏原之一。6、过敏反应

青霉素过敏原因可能是因为蛋白质或多肽等大分子物质与青霉素或其降解产物结合，引发机体免疫变态反应。包含过敏性休克、药疹、血清病型反应等。若发生过敏反应，应紧急抢救，用人工呼吸、肾上腺素药品。抗生素发酵工艺第196页应用青霉素不可与同类抗生素连用青霉素不可与磺胺和四环素联适用药青霉素不可与氨基糖苷类混合输液抗生素发酵工艺第197页生产工艺生产孢子制备发酵提炼抗生素发酵工艺第198页生产孢子制备将砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨培养基培养再移植到大米或小米固体培养基上，25℃培养7d干燥、低温保留抗生素发酵工艺第199页发酵产黄青霉素

斜面孢子

米孢子

种子罐

发酵罐

发酵液

发酵滤液真空冷冻干燥或液氮保藏孢子琼脂斜面培养基上25℃培养7-9d用斜面孢子悬浮液接种于大米或小米基质上25℃培养6-7d用孢子米粒或孢子悬浮液接种，26℃通气、搅拌培养60-68h用种子罐按照10%-15%体积接种，在25℃通气，搅拌补料分批培养200-240h冷却至5℃左右、絮凝、过滤抗生素发酵工艺第200页提炼发酵滤液一次萃取一次水提取二次萃取脱色液结晶混悬液湿晶体青霉素工业盐抗生素发酵工艺第201页工艺关键点1、发酵温度控制

产黄青霉素生长最适温度为27℃-30℃，而分泌青霉素适宜温度是20-24℃，实际生产中采取26℃-27℃。为使温度适合于不一样发酵阶段需要，普通采取变温控制。2、发酵PH控制

青霉素发酵最适PH值普通控制在PH6.5-7.0，当PH较高时可经过加糖或天然油脂进行控制；当PH较低时可加入碳酸钙；或氨水进行调整。抗生素发酵工艺第202页3、溶氧浓度控制

青霉素发酵属好氧发酵，故溶氧浓度是影响青霉素产率一个主要原因。当溶氧浓度低于30%时，青霉素产率急剧下降。抗生素发酵工艺第203页第二节红霉素发酵工艺一、概述（一）红霉素及其理化性质

红霉素是大环内酯类抗生素。（二）药理作用及应用范围

红霉素是广谱抗生素，对G+菌作用强，用于治疗腹泻、菌痢、胆结石、胆囊炎、疟疾、绿脓杆菌继发感染、支气管炎、哮喘和脓毒性心内膜炎皆有效。还起到防治心脏病作用。抗生素发酵工艺第204页二、红霉素发酵工艺过程（一）菌种

红霉素产生菌是红色糖多孢菌抗生素发酵工艺第205页（二）发酵工艺流程沙土孢子斜面母瓶斜面子瓶一级种子罐二级种子罐（繁殖罐）发酵罐放罐孢子培养37℃，7-10天孢子培养37℃，7-10天种子培养35℃，60-70h种子培养33-35℃，35-40h发酵培养31℃，150-160h抗生素发酵工艺第206页(三)发酵工艺过程1、生产孢子制备工艺

斜面孢子培养基组分为淀粉、硫酸铵、氯化钠、玉米浆、碳酸钙、琼脂。2、发酵工艺

红霉素大规模生产普通是将其孢子悬液接入种子罐，种子扩充培养2次后移入发酵罐进行发酵。抗生素发酵工艺第207页（四）发酵工艺控制关键点1、种子质量控制

成熟斜面孢子呈深米色，色泽新鲜、均匀、无黑点，后面产生红色或红棕色色素。2、培养基控制

①碳源主要以葡萄糖为主，其次为淀粉。生产上普通用母液糖

②氮源以黄豆饼粉为主，其次为玉米浆和硫酸铵

③前体生产上采取发酵过程加入丙酸或丙醇作为前体以提升红霉素A产量。抗生素发酵工艺第208页3、培养条件控制

①通气和搅拌1：（0.8-1.2）v/v/m

②温度普通采取全程31℃培养

③PH值6.6-7.2

④中间补料还原糖控制在1.2-1.5%范围内；有机氮源补加依据发酵液黏度大小决定补入量；前体在24-39h，发酵液变浓、PH值高于6.5时开始补入。

⑤通氨发酵后期抗生素发酵工艺第209页

⑥发酵液黏度控制适当提升发酵液黏度，可经过减慢搅拌转速，改变搅拌叶型式、降低罐温、增加有机氮源补量，滴加氨水等实现。

⑦泡沫与消沫植物油做消沫剂抗生素发酵工艺第210页4、异常情况及处理（1）停电影响2h影响发酵单位水平，100h影响发酵液以及成品质量

（2）染菌处理

降温至28℃培养，并加入洁尔灭

（3）发酵液浓度尤其低

加入酵母粉和蛋白胨抗生素发酵工艺第211页第三节螺旋霉素发酵工艺一、概述1、螺旋霉素及其理化性质

螺旋霉素易溶于有机溶媒，化学性质稳定，是经典大环内酯类抗生素，产生菌为链霉菌属。2、药理作用

螺旋霉素经酰化反应合成乙酰螺旋霉素，组织浓度高，毒性低，体内疗效长，含有较强抗生素后续作用（PAE）对革兰氏阳性菌与奈瑟氏球菌有很好抗菌作用，口服吸收良好。抗生素发酵工艺第212页二、工艺流程发酵工艺流程

菌种甘油冷冻管解冻

一级摇瓶培养26-28℃，培养24h

二级摇瓶培养26-28℃，培养24h

一级种子罐培养26-28℃，培养24h

二级种子罐培养26-28℃，培养24h

发酵罐发酵生产25-27℃，培养100h

发酵液放罐抗生素发酵工艺第213页发酵设备流程

菌种甘油冷冻管一级摇瓶（500mL）二级摇瓶（500mL）一级种子罐（500L）二级种子罐（4000L）发酵罐（30m3）抗生素发酵工艺第214页三、生产过程1、菌种

普通选取螺旋霉素链霉菌经屡次诱变（紫外光照&光修复）后取得高产菌种。2、种子和发酵培养基3、一级摇瓶菌丝制备

将保留冷冻管取出，放置室温或37℃恒温室化冻后，在无菌条件下吸3.5mL冷冻液接入有75mL培养基一级摇瓶，27℃振荡培养24h。抗生素发酵工艺第215