分子生物学实验设计蚕豆病

分子生物学实验设计蚕豆病案例：患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。临床表现：体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。2021/4/272病例样本标准值意义红细胞1.98×1012/L4.3~4.5×1012/L↓血红蛋白53g/L170-200g/L

↓血清总蛋白85.5µmol/L5.13~18.8µmol/L

↑

结合胆红素13.7µmol/L1.71~6.84µmol/L

↑

未结合胆红素71.8µmol/L3.42~11.96µmol/L

↑

尿蛋白（++）

(－)

轻度蛋白尿潜血(+)

(－)

血管内溶血尿胆红素(－)

(－)

－尿胆原素(+)

少量↑

实验室检查：2021/4/2731、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？2、请设计实验进一步明确诊断。3、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。必答题：5、患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？选答题：2021/4/274恶心、呕吐、面色苍白皮肤及巩膜黄染红细胞1.98×1012/L血红蛋白53g/L血清总胆红素85.5µmol/L尿蛋白（++）尿胆红素(－)尿胆素原(+)尿液镜下未见红细胞黄疸红细胞膜不完整，已破裂红细胞含量少含量明显增加血红蛋白量减少排尿呈酱油样色游离胆红素增加溶血性黄疸初步诊断为：红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症（蚕豆病）肠肝循环增多1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？症状正常红细胞溶血性贫血红细胞2021/4/275蚕豆病简介蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。易发人群多见于儿童，男性患者约占90%以上。发病机制G6PD↓→NADPH+H+↓→GSH↓→红细胞的抗氧化能力↓发生溶血左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）2021/4/276早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾肿大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于1～2日内死亡。主要临床表现：2021/4/2772、设计实验进一步明确诊断。贫血、黄疸有和无遗传史无或有诱因（食用蚕豆、服用药物、感染）体征：脾肿大、黄疸血常规检查血清学检查检查HA的病因G6PD筛选试验G6PD确诊试验Hb↓、网织红细胞↑间接胆红素↑尿胆原↑游离Hb↑结合珠蛋白↓怀疑其他HA,相应病因检测结果正常G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定G6PD基因分析其他筛选试验高铁血红蛋白还原试验初诊或确诊G6PD缺陷症确诊溶贫（血管内溶血）确诊G6PD做1项或2项做1项2021/4/278高铁血红蛋白还原试验筛选试验→确诊试验G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定实验名称：2021/4/279高铁血红蛋白还原试验实验一2021/4/2710实验原理在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）亚铁血红蛋白NADPH(辅酶)亚甲蓝(递氢体)

高铁血红蛋白还原酶高铁血红蛋白（实验方向）2021/4/27110.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、0.4mmol/L亚甲蓝溶液②、0.28mol/L葡萄糖溶液③、混合液（等量①+②+③）、生理盐水、抗凝剂紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支主要试剂和仪器

主要试剂：仪器：2021/4/2712实验操作流程取静脉血1.8mL于抗凝管，混匀抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝剂+葡萄糖20mg)离心沉淀1000r/min15min调整血细胞∶血浆=1∶1，混匀→调整后全血（备用）1ml

0.18mol/L亚硝酸钠1ml0.28mol/L葡萄糖溶液1ml0.14mmol/L亚甲基蓝液混匀→混合试剂（备用）2021/4/2713取试管3支,标上A、B、S,按下表加入试剂高铁血红蛋白还原试验操作步骤混合试剂/mL0.01//生理盐水/mL/0.01/0.18mol/L亚硝酸钠-//0.010.28mol/L葡萄糖溶液/mL经调整的全血/mL0.10.10.1来回摇动15～20次,置37℃水浴箱静置3h蒸馏水10.00ml10.00ml10.00ml试剂ABSB管为空白管,在波长635nm处，测定“A”管及“S”管吸光度2021/4/2714计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb%=(1-A/S)×100%

2021/4/2715注意事项1、血细胞比容比值过低，高铁血红蛋白还原率降低。应将血细胞比容调整到0.35-0.402、细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等应无菌3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果，故应2h内送检4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较全血缺乏2021/4/2716结果分析方法正常值：MHb还原率>=75%，脐血>=77%临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者：MHb还原率<30%脐血<40%杂合子患者：MHb还原率<31%~74%脐血<41%~76%2021/4/2717实验二G6PD荧光斑点试验2021/4/2718实验原理

葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性G6P6PGAG6PDNADPNADPH2021/4/2719反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀长波紫外灯、滤纸、水浴箱主要试剂和仪器试剂：仪器：2021/4/2720实验操作流程取试管，加10μl全血+100μl反应液，混匀，取一滴于滤纸上（第一斑点）→作为对照将上液置于37℃水浴10min，再取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）→实验组

晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果，计时根据结果作出相应诊断2021/4/2721注意事项1、检测的第一点作为实验对照应无荧光或弱荧光出现2、每次试验应用正常标本（已知G-6-PD正常）作阴性对照。如可能选用已知G-6-PD缺乏者的标本作阳性对照3、如贫血严重取血量应相应加大，或用红细胞混悬液进行检验4、为提高敏感性可在反应液中加入1份8.0mmol/LGSSG2021/4/2722结果分析正常人：0min斑点无荧光，5-10min出现，10min荧光最强临床诊断：轻度缺陷者：0-10min荧光很弱或不出现中度缺陷者：10-30min出现荧光严重缺陷者：30min内不出现荧光2021/4/2723实验三红细胞G6PD活性测定2021/4/2724实验原理

基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是利用紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度（测6次），求每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。方法：①WHO推荐的Zinkham;②NBT定量法等2021/4/2725生理盐水、溶血素、3.8mmol/LNADP、0.5mol/LTris缓冲液（pH7.5）、0.63mol/L氯化镁溶液、33mmol/LG-6-P液紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管主要试剂和仪器试剂：仪器：2021/4/2726实验流程取抗凝血2ml，生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心10min）除去上清液和乳白层（白细胞和血小板）加等体积生理盐水→红细胞悬液红细胞悬液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min→

溶血液并测定其Hb浓度进行比色（见下表）2021/4/2727G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法)试管对照管测定管NADP液（ml）0.10.1Tris液（ml）0.10.1氯化镁液（ml）0.10.1蒸馏水（ml）0.680.58G6P液（ml）—0.1

37℃预热溶血液（μl）2020立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37℃恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化2021/4/2728计算公式：G-6-PD活性（U/gHb）=△A/min×1000/6.22×1020/20×Hb(gL-1)△A/min:每min吸光度的平均变化值1000/6.22:为微摩尔消光系数1020/20:总容量与溶血液的量之比；2021/4/2729注意事项

1、急性溶血期后2~3个月再查或复查G6PD活性2、最好同时作阴性对照和阳性对照（影响因素多）3、离心沉底后应取底层红细胞测定G6PD活性2021/4/2730结果分析G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以上即可作出诊断方法正常值范围WHO推荐的Zinkham（12.01±2.09)IU/gHb(37℃)ICSH推荐的Glock与McLoan法（8.34±1.59）IU/gHb(37℃)NBT定量法（13.1~30.0）NBT单位Chapman和Dern法（2.8~7.31）IU/gHb(25℃)2021/4/2731根据实验结果该男孩患蚕豆病2021/4/27323.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。

①细胞膜的破坏②胆红素的异常2021/4/2733

红细胞膜的破坏

葡萄糖磷酸戊糖途径葡萄糖

6–磷酸葡萄糖

5–磷酸核糖NADPH+H+磷酸化5–磷酸核糖