植物生理实验四专家讲座

试验四、

过氧化氢酶活性测定

（高锰酸钾滴定法）植物生理实验四专家讲座第1页过氧化氢酶（CAT）普遍存在于植物全部组织中，其活性与植物代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。植物生理实验四专家讲座第2页过氧化氢酶活性测定方法：氧电极法比色法化学发光法滴定法植物生理实验四专家讲座第3页

过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可依据H2O2消耗量或O2生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多出过氧化氢。即可求出消耗H2O2量。

5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4→5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4

一、试验原理植物生理实验四专家讲座第4页（一）材料：新鲜植物叶片（二）仪器设备：1.研钵；2.试管；3.酸式滴定管；4.恒温水浴锅；5.容量瓶/量筒。二、材料、仪器设备及试剂植物生理实验四专家讲座第5页（三）试剂：1.10%H2SO4；2.0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液；3.0.1mol/L高锰酸钾标准液:KMnO43.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L草酸溶液标定；植物生理实验四专家讲座第6页4.0.1mol/LH2O2：市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/LKMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.0.1mol/L草酸：称取H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。植物生理实验四专家讲座第7页（一）酶液提取：取植物叶片1g加入pH7.8磷酸缓冲溶液少许，研磨成匀浆，转移至20ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至20ml容量瓶/量筒中，用同一缓冲液定容，４000rpm离心1５min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。三、试验步骤植物生理实验四专家讲座第8页（二）取2个试管（一个测定，另一个对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml（100℃加热2分钟），再加入2.5ml0.1mol/LH2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温15min，马上加入10%H2SO42.5ml。用0.1mol/LKMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。植物生理实验四专家讲座第9页样品对照酶液2.5ml酶液2.5ml（100℃加热2分钟）2.5ml0.1mol/LH2O22.5ml0.1mol/LH2O230℃恒温水浴中保温15min30℃恒温水浴中保温15min10%H2SO42.5ml10%H2SO42.5ml0.1mol/LKMnO4（Bml）0.1mol/LKMnO4

（Aml）植物生理实验四专家讲座第10页1.酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2mg数表示：

过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）×VT/(W×VS×1.7×t)式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）；VS反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）；t反应时间（min）；1.71ml0.1mol/LKMn