临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座

-化学发光-荧光偏振-微粒子酶放大化学发光电化学发光-时间分辨免疫荧光抗体芯片透射和散射比浊流式细胞技术-免疫扩散-免疫沉淀/免疫凝集-ELISA-IFARIAICT

免疫学和自动化技术在临床免疫学诊疗领域中应用将大大加速临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第1页标识免疫学分析技术发展历程免疫荧光分析(Coons,1941)放射免疫分析(Berson和Yalow,1960)酶联免疫吸附分析(Engvall,1971)金标免疫分析(Faulk和Taylor,1971)化学发光免疫分析(Arakawa，1977)时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)电化学发光免疫分析(Leland,1990)临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第2页放射免疫诊疗技术（RIA）酶联免疫诊疗技术（ELISA）化学发光免疫诊疗技术（CLIA）20世纪60年代70年代80年代90年代年年时间近代临床免疫诊疗技术发展历程临床免疫诊疗技术发展基本历经了以下三个阶段：临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第3页方法中国欧美放射免疫法（RIA）1.兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院；2.产品处于衰退期；3.厂商试剂与仪器共同开发，试剂基本系列化。1.兴起于20世纪60年代，现已基本退出临床应用；2.产品生命周期已终止；3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂基本系列化酶联免疫法（ELISA）1.兴起于20世纪80年代，现普遍使用于各级临床机构，为我国临床免疫诊疗基本方法；2.产品处于成熟期；3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂还未系列化。1.兴起于20世纪70年代，现仍在临床应用；2.产品处于衰退期；3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂基本系列化。化学发光免疫法（CLIA）1.导入于20世纪90年代，逐步进入各大中医院；2.产品处于快速成长久；3.正逐步实现试剂和仪器共同开发，试剂逐步系列化1.兴起于20世纪80年代，现已被临床普遍使用，成为临床免疫诊疗支柱方法；2.产品处于成熟期；3.厂商试剂与仪器共同开发，仪器自动化程度高，试剂系列化状态好。近代临床免疫诊疗技术发展历程临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第4页技术成熟度高放射性（125I）污染和危害125I半衰期短，试剂使用期短标识物125I稳定性差，批间、批内变异较大标准曲线使用期短，必须每次定标操作繁琐，出汇报时间长无法保留备用。放射免疫技术（RIA）

RosalynYalow,1977临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第5页成本低廉定性、半定量和定量均能够检测O.D值在低中浓度范围与酶活性呈线性关系能够肉眼简单判读或酶标仪准确判读结果酶免疫分析技术(EIA)临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第6页灵敏度高，检测低限达10-19mol测定范围宽，可达9个数量级自动化程度高，操作简单试剂稳定性好，无污染使用期6－24月化学发光免疫分析（CLIA）临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第7页BAYERACS180AxSYMElecsysSystemAccess®2ImmunoassaySystem临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第8页最先进免疫学分析技术之一非开放性试剂系统；试剂价格过高

电化学发光免疫测定（Electrochemiluminescenceimmunoassay,ECLI）是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合产物。它标识物发光原理与普通化学发光（CL）不一样，是一个在电极表面由电化学引发特异性化学发光反应，实际上包含了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL差异在于ECL是电开启发光反应，而CL是经过化合物混合开启发光反应。ElecsysSystem临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第9页免疫学检验技术发展趋势快速简便准确灵敏集成高通量

金标免疫层析检测磁珠免疫层析检测

化学发光时间分辨荧光

AlphaScreen

阵列芯片液相悬浮芯片临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第10页化学发光免疫分析技术及其在临床诊疗中应用临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第11页

简史：本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光化学反应分析超微量物质，尤其是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。当前，这一技术已从试验室稀有技术过渡到临床医学常规检测伎俩。原理：发光底物在酶作用下，底物发生化学反应并释放出大量能量，产生激发态中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与催化酶量成正比,由此能够建立标准曲线并计算样品中待测物质含量.

CLIA试剂盒国产化程度已经较高，质量与国外产品差距逐步减小。缺乏国产化自动检测仪器化学发光免疫分析发展史CLIA临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第12页发光检测方法分类和对比

类型

原理

试剂

发光类型化学发光免疫分析(CLIA)化学发光物质直接标识抗原(体)

吖啶酯异鲁米诺

闪光型化学发光酶免疫分析(CLEIA)在酶免疫分析完成后加入底物鲁咪诺系统AMPPD系统

辉光型电化学发光免疫分析（ELCIA)电致化学发光与电化学伎俩相结合三联吡啶钌三丙氨系统

闪光型荧光免疫分析依据抗原抗体反应原理，先将已知抗原或抗体标识上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内对应抗原（或抗体）

荧光素

闪光型

临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第13页【化学发光免疫分析种类】

1.直接化学发光A吖啶酯发光原理：纳米磁珠分离后吖啶酯标识抗原抗体复合物，在含H2O2强酸、强碱激发底物作用下，快速发出可见光，经过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。特点：发光过程在5秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标识物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性。代表仪器：拜耳企业ACS180，雅培Architect。临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第14页原理图临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第15页【化学发光免疫分析种类】B异鲁米诺发光原理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更加快，在3秒内完成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解缺点。代表仪器：德国Byk–Sangtec企业LIAISON临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第16页原理图临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第17页2、酶促化学发光或持久发光原理：酶促化学发光普通是将碱性磷酸酶（AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标识在抗体或抗原上，固相抗体或抗原与AP或HRP标识抗原、抗体复合物在发光底物AMPPD或Luminol作用下，连续发出可见光，经过光电倍增管读取光信号。特点：碱磷酶体系：水解反应，起光较慢，发光强度较弱，灵敏度较高。辣根酶体系：氧化还原反应，起光较快，发光强度较大。代表仪器和试剂：进口品牌：强生VitrosECi（鲁米喏），美国贝克曼企业ACCESS（AMPPD）。国产主要厂家：郑州安图（HRP-LUMINOL)

、北京源德（HRP-LUMINOL)

、泰格可信（HRP-LUMINOL)

、科美东雅(AMPPD)、威海威高（HRP-LUMINOL)等【化学发光免疫分析种类】临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第18页VitrosECi（鲁米喏）原理图英国强生VitrosECi（鲁米喏）

临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第19页3、电化学发光原理：纳米磁珠分离后三联吡啶钌标识抗原抗体复合物，在三丙胺作用下，发生氧化还原反应，发出可见光，经过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。特点：激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程约需25秒，测试速度慢。代表仪器：瑞士ROCHE企业ELECSYS1010和ELECSYS。【化学发光免疫分析种类】临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第20页电化学发光检测技术（ELECSYS1010ELECSYS）原理图罗氏（RocheDiagnostics）临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第21页1结合了活化三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2++N羟基琥珀酰胺酯（NHS）抗-HBs和结合了生物素抗-HBs与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟

操作步骤临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第22页将被链霉亲和素包被磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素经过与亲和素结合将磁珠、抗-HBs连接为一体，形成双抗体夹心法临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第23页临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第24页3蠕动泵将形成[Ru(bpy)3]2+－抗体－抗原－抗体－磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面磁铁吸附于电极表面。同时，游离抗-HBs（与生物素结合和与[Ru(bpy)3]2+结合抗体）也被吸出测量室

临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第25页4蠕动泵加入含三丙胺（TPA）缓冲液，同时电极加电压，开启ECL反应过程临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第26页临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第27页5终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用专家讲座第28页4、免疫荧光4.1时间分辨免疫荧光（TRFIA)

美国PerkinElmer

芬兰Wallac

新波达安基因4.2光激化学发光（Lica）博阳

4.3各种技术综合美国雅培AxSYMMEIA

日本东曹ME