免疫沉淀技术专家讲座

免疫沉淀技术免疫沉淀反应定义免疫化学基础免疫沉淀技术分类免疫沉淀技术应用免疫沉淀技术专家讲座第1页免疫沉淀技术免疫沉淀反应定义免疫化学基础免疫沉淀技术分类免疫沉淀技术应用免疫沉淀技术专家讲座第2页免疫沉淀反应

可溶性抗原与对应抗体在液相或凝胶中特异性结合后，形成免疫复合物在一定条件下出现蛋白质析出现象。与凝集反应、中和反应、补体参加抗原抗体反应并称经典免疫学技术

免疫沉淀技术专家讲座第3页免疫沉淀技术免疫沉淀反应定义免疫化学基础免疫沉淀技术分类免疫沉淀技术应用免疫沉淀技术专家讲座第4页沉淀反应原理沉淀原（precipitinogen）沉淀素（precipitin）免疫沉淀技术专家讲座第5页抗原抗体间力免疫沉淀技术专家讲座第6页疏水性改变电荷改变分子量及结构改变沉淀发生免疫沉淀技术专家讲座第7页抗原价免疫沉淀技术专家讲座第8页抗体价IgG、IgA、IgD和IgE类抗体：两价分泌型IgA：四价IgM类抗体：十价免疫沉淀技术专家讲座第9页亲和力和亲协力affinityavidity免疫沉淀技术专家讲座第10页抗原抗体反应特异性免疫沉淀技术专家讲座第11页特异性物质基础epitope免疫沉淀技术专家讲座第12页交叉反应免疫沉淀技术专家讲座第13页交叉反应物质基础1.抗原异质性（antigenheterogeneity）2.共同抗原决定簇

（commonantigenicdeterminant）3.决定簇相同免疫沉淀技术专家讲座第14页共同抗原类型1.同种抗原2.嗜异性抗原（又称Forssman抗原）免疫沉淀技术专家讲座第15页抗原抗体反应最适百分比免疫沉淀技术专家讲座第16页抗原抗体反应阶段性抗原抗体结合阶段2.抗原抗体反应阶段免疫沉淀技术专家讲座第17页抗原抗体反应影响原因1．中性盐作用2．pH3．温度4．离子强度免疫沉淀技术专家讲座第18页中性盐作用加入高浓度盐（如硫酸铵）以脱水，或者用分子量大约6000，浓度3～4%聚乙二醇（PEG6000），以其多聚物孔隙排阻脱水来大大降低抗原抗体复合物溶解度。免疫沉淀技术专家讲座第19页pH值尽可能调整pH至复合物等电点附近，通常此pH值是介于IgG等电点（约pH=7）和抗原等电点之间，也依赖于抗原与抗体百分比。免疫沉淀技术专家讲座第20页温度温度与抗原抗体反应有亲密关系温度升高可促使分子运动加紧，抗原与抗体碰撞机会多，轻易结合，但也轻易再解离;

温度低，分子运动慢，撞击机会少，但一旦结合后则不易再分开。免疫沉淀技术专家讲座第21页离子强度（1）有利于抗原抗体结合条件：

中等或较低离子强度（2）有利于抗原抗体解离条件：

高离子强度免疫沉淀技术专家讲座第22页免疫沉淀技术免疫沉淀反应定义免疫化学基础免疫沉淀技术分类免疫沉淀技术应用免疫沉淀技术专家讲座第23页沉淀反应种类

1．溶液中沉淀反应

2．凝胶中沉淀反应免疫沉淀技术专家讲座第24页溶液中沉淀反应是指在清彻透明液体中，呈溶解状态抗原与抗体在试管内或凹玻片上混匀，可凝聚成为肉眼可见絮状或颗粒状不溶性沉淀物。免疫沉淀技术专家讲座第25页絮状沉淀试验康氏反应（Kahn‘stest）:心肌提取类脂质抗原+反应素（Aegagin）敏感性高，特异性差，易出现假阳性。(1991年首批淘汰)性病研究试验室法(venerealdiseaseresearchlaboratory，VDRL)心拟脂及卵磷酯+反应素（Aegagin）不需加热血清反应素试验(unheatedserumreagin)心拟脂及卵磷酯+氯化胆碱+反应素（Aegagin）免疫沉淀技术专家讲座第26页反应最适比测定（1）抗原稀释法（Dean-Webb法）（2）抗体稀释法（Ramon法）（3）方阵法或棋盘格滴定法（checkerboardtitration）免疫沉淀技术专家讲座第27页环状沉淀试验

（ringprecipitationtest）Ascoli于1902年建立用于检验兽类内脏、毛皮浸液等标本中炭疽杆菌抗原免疫沉淀技术专家讲座第28页免疫比浊法

（immunoturbidimetry）优点：校正曲线稳定，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染缺点：特异性、灵敏度稍差免疫沉淀技术专家讲座第29页免疫比浊法分类（1）透射比浊法（transmissionturbidimetry）（2）散射比浊法（nephelometry）（3）免疫胶乳浊度测定法（immunolatexturbidimetry）（4）速率抑制免疫比浊法（rateinhibitionimmunoturbidimetry）免疫沉淀技术专家讲座第30页免疫沉淀技术

（Immunoprecipitationassay）免疫沉淀技术专家讲座第31页关键原因抗原丰度抗体结合能力蛋白和抗体可接触性免疫沉淀技术专家讲座第32页应用范围免疫沉淀技术专家讲座第33页免疫共沉淀技术

（Co-Immunoprecipitationassay）免疫沉淀技术专家讲座第34页结果分析NatImmunol.Apr;9(4):369-77.免疫沉淀技术专家讲座第35页GSTPULLDOWN免疫沉淀技术专家讲座第36页结果分析PNASFebruary26,vol.105no.82836-2841免疫沉淀技术专家讲座第37页应用范围寻找新相互作用蛋白验证目标蛋白和待测蛋白是否有相互作用免疫沉淀技术专家讲座第38页免疫共沉淀不足（1）难以检测低亲和力和短暂相互作用（2）不能够确切分辨第三种蛋白桥联作用（3）灵敏度不如亲和色谱高（4）需对未知蛋白相关信息有一定了解免疫沉淀技术专家讲座第39页基因转录调控免疫沉淀技术专家讲座第40页染色质免疫共沉淀免疫沉淀技术专家讲座第41页染色质免疫共沉淀免疫沉淀技术专家讲座第42页结果分析MolCancerTherJunevol.9no.61764-1774免疫沉淀技术专家讲座第43页RNA免疫沉淀在生理状态下对结合在RNA上蛋白质进行免疫沉淀，然后经过基因芯片或者其它伎俩检测目标RNA含量。免疫沉淀技术专家讲座第44页应用范围研究蛋白与DNA动态作用研究组蛋白各种共价修饰与基因表示之间关系研究蛋白与RNA相互作用免疫沉淀技术专家讲座第45页免疫沉淀中抗体选择免疫沉淀技术专家讲座第46页免疫共沉淀技术应用免疫沉淀技术专家讲座第47页凝胶中沉淀反应以一定浓度（1～2%）琼脂（或琼脂糖）凝胶作为介质，将抗原、抗体溶液分别放在琼脂凝胶板上并使它们彼此在凝胶中自由扩散，形成浓度梯度，当抗原与抗体相遇且百分比适当初，在对应位置即可出现可见沉淀环或沉淀线。免疫沉淀技术专家讲座第48页沉淀线特点形成沉淀线特异性抗原抗体无法经过沉淀线，只能在沉淀线周围形成沉淀与沉淀线无关抗原和抗体分子则能够自由经过沉淀线位置与抗原抗体浓度和迁移率有直接关系免疫沉淀技术专家讲座第49页单相免疫扩散试验

（singleimmunodiffusion）免疫沉淀技术专家讲座第50页双向免疫扩散试验

（doubleimmunodiffusion）免疫沉淀技术专家讲座第51页沉淀线分析ABCDEFAgAb免疫沉淀技术专家讲座第52页沉淀线分析免疫沉淀技术专家讲座第53页免疫电泳

（immunoelectrophoresis）免疫沉淀技术专家讲座第54页对流免疫电泳

（counterimmunoelectrophoresis）免疫沉淀技术专家讲座第55页火箭免疫电泳

（rocketimmunoelectrophoresis）免疫沉淀技术专家讲座第56页交叉免疫电泳

（crossedimmunoelectrophoresis）免疫沉淀技术专家讲座第57页免疫固定电泳

（immunofixationelectrophoresis）首先将蛋白质抗原进行电泳分离，电泳后直接将抗体加于蛋白质区带表面，抗体与对应抗原就会直接结合，形成复合物嵌于固相支持物中。UrineImmunofixationElectrophoresis免疫沉淀技术专家讲座第58页免疫印迹技术

（immunoblotting）免疫沉淀技术专家讲座第59页基本流程一．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）1.搜集蛋白样品：贴壁细胞、组织、药品处理细胞2.蛋白质浓度测定：BCA3.电泳：10％分离胶、4％浓缩胶4.电泳结果检验二.电转移毛细管印迹法和电泳印迹法免疫沉淀技术专家讲座第60页转移膜选择

NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率高高高背景低较高低结合能力80－110ug/cm2>400ug/cm2125－200ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质结合）材料质地干NC膜易脆软而坚固机械强度高溶剂耐受性无无有操作程序缓冲液润湿,防止气泡缓冲液润湿100%甲醇润湿检测方式常规染色，可用放射性和非放射性检测不能用阴离子染料常规染色，比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测适用范围0.45um普通蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白低浓度小分子蛋白、酸性